夏堇转Chitinase和玉米Lc转录因子基因研究

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本文对夏堇(Torenia fournieri Lind.)转HearNPV Chitinase基因和玉米Lc转录因子进行了研究,主要以夏堇为模式植物探讨外源基因的表达情况,旨在通过转基因手段提高植物体内的几丁质酶含量和黄酮类物质含量,从而增加植物抗病性,并为其他植物的转基因研究奠定基础。主要研究结果如下:通过PCR的方法扩增出HearNPV ChiA基因(删除了信号肽序列和内质网定位序列)、玉米Lc转录因子,将其克隆进植物表达载体pBI121中,构建了重组植物表达载体ChiA- pBI121,中间载体Lc-pBI121和双价重组植物表达载体Lc-ChiA-pBI121。同时,将其转化根癌农杆菌LBA4404,成功构建了转基因工程菌ChiA-pBI121-LBA4404和Lc-ChiA-pBI121-LBA4404。通过根癌农杆菌介导的方法对夏堇叶片外植体进行遗传转化研究,获得了8个转ChiA基因株系,分别命名为C1、C2、C3、G2、G3、A1、A2、A3。半定量RT-PCR分析表明8个转基因株系ChiA基因mRNA相对表达量明显高于对照组(P<0.05),株系之间的相对表达量也不相同,其中C3株系最高,A2株系最低。证明HearNPV ChiA基因在夏堇体内能够正常表达。几丁质酶活性分析表明,株系C1、C2、A1和A2的几丁质酶活性明显高于对照组,其中株系A1的几丁质酶活性最高。8个转ChiA基因株系中,7个株系转基因苗均出现花期提前的现象,具体现成机制不明。此外,经过长期筛选还获得了3株转Lc和ChiA双价基因的抗性芽,虽然相关表达水平、色素含量等检测尚未进行,但获得的转双价基因材料为筛选高效的联合抗病新植株奠定了良好的基础。
摘要第5-6页
ABSTRACT第6页
第一章 文献综述第9-14页
    1.1 夏堇研究概述第9-10页
        1.1.1 夏堇是理想的实验材料第9页
        1.1.2 夏堇转基因体系研究第9-10页
        1.1.3 夏堇花色、花型、花期调控研究第10页
    1.2 杆状病毒几丁质酶研究第10-12页
    1.3 玉米Lc 基因研究第12-14页
第二章 论文研究内容第14-16页
    2.1 夏堇转HearNPV ChiA 基因研究第14页
        2.1.1 重组克隆载体的构建第14页
        2.1.2 重组植物表达载体的构建第14页
        2.1.3 根癌农杆菌介导的夏堇叶片的遗传转化第14页
        2.1.4 抗性植株的PCR 检测第14页
        2.1.5 抗性植株的半定量RT-PCR(Semi-Quantitative RT-PCR)分析第14页
        2.1.6 抗性植株几丁 , 质酶活性的检测第14页
    2.2 夏堇转HearNPV ChiA 和玉米Lc 双价基因研究第14-16页
        2.2.1 重组克隆载体的构建第14-15页
        2.2.2 双价植物表达载体 Lc-ChiA-pBI121 的构建第15页
        2.2.3 根癌农杆菌介导的夏堇叶片的遗传转化第15-16页
第三章 夏堇转HearNPV ChiA 基因研究第16-31页
    3.1 实验材料第16-17页
        3.1.1 植物材料第16页
        3.1.2 菌种和载体第16页
        3.1.3 常规试剂和工具酶第16页
        3.1.4 试剂配制第16-17页
    3.2 实验方法第17-23页
        3.2.1 重组植物表达载体的构建第17-19页
        3.2.2 重组载体ChiA-pBI121 转化农杆菌LBA4404第19-20页
        3.2.3 根癌农杆菌介导的夏堇叶片的遗传转化第20页
        3.2.4 抗性植株的PCR 检测第20-21页
        3.2.5 抗性植株的半定量RT-PCR(Semi-Quantitative RT-PCR)分析第21-22页
        3.2.6 抗性植株几丁质酶活性的检测第22-23页
    3.3 结果与分析第23-29页
        3.3.1 ChiA 基因的克隆与重组植物表达载体的构建第23-25页
        3.3.2 抗性植株的获得第25页
        3.3.3 抗性植株的PCR 检测第25-26页
        3.3.4 抗性植株的半定量RT-PCR(Semi-Quantitative RT-PCR)分析第26-27页
        3.3.5 抗性植株几丁质酶活性的检测第27-29页
        3.3.6 转基因夏堇花期提前现象第29页
    3.4 小结与讨论第29-31页
        3.4.1 小结第29-30页
        3.4.2 讨论第30-31页
第四章 夏堇转HearNPV ChiA 和玉米Lc 双价基因研究第31-38页
    4.1 实验材料第31页
        4.1.1 植物材料第31页
        4.1.2 载体和生化试剂第31页
    4.2 实验方法第31-34页
        4.2.1 引物设计合成第31页
        4.2.2 PCR 扩增及产物回收第31-32页
        4.2.3 重组载体的构建第32-34页
        4.2.4 根癌农杆菌介导的双价基因转化夏堇叶盘第34页
    4.3 结果与分析第34-37页
        4.3.1 Lc 基因和35S-ChiA-NOS 片段克隆第34页
        4.3.2 双价重组植物表达载体的构建第34-37页
        4.3.3 转双价基因抗性芽的获得第37页
    4.4 小结与讨论第37-38页
        4.4.1 小结第37页
        4.4.2 讨论第37-38页
第五章 结论与讨论第38-40页
    5.1 结论第38页
    5.2 讨论第38-40页
参考文献第40-44页
致谢第44-45页
作者简介第45页
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