一种新型的细胞防护剂（复合物NADH）的提取、分离和纯化工艺的初步研究

研究背景和研究目的： 生命现象的实质是能量的不断流动，生物的生命维持、细胞生长和更新，都需能量才能进行。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)广泛存在于一切活细胞中，是细胞能量代谢所必需的辅酶。1分子NADH还原可产生3分子ATP，36千卡能量。它在维持细胞生长、分化和能量代谢中起十分重要的作用。 NADH不仅是酶促反应中一种重要的生化辅因子，同时也是一种有效的细胞保护剂。科学研究证明，包括心血管疾病、癌症以及许多老年病(如Alzheimer’s病、Parkinson’s症和其它神经退行性变)在内的八十多种疾病与自由基损伤有关，NADH是体内最有效的抗氧化剂，可使机体免受自由基损伤。作为一种新型细胞保护剂，它在修复细胞损伤；提高细胞应激反应能力；降低化疗药物、放射线及化学毒剂对正常组织和细胞的毒性损伤作用等方面，有直接而有效的作用，作为一种独特的天然物质，具有非常广泛的应用前景。因此，研究一种能经济、大规模、高效地制备、提取纯化NADH的新方法，具有重大的社会效益和经济效益。 我们希望通过本实验的研究，可以寻找出更为经济、高效、简便的提取、分离和纯化辅酶NADH的工艺条件并进行优化，为下一步中试放大和工业化生产积累经验。进而研制出以NADH为主体的新型细胞保护剂，为今后临床疾病的细胞保护治疗及军事医学领域细胞损伤的防护提供更加有效的措施和手段。方法和结果：1．NADH粗提方法 使用化学渗透法处理啤酒酵母细胞hoe切romyces cerev。s。e，采用Lud正交设计，比较酵母细胞浓度、乙醚用量、提取时间对NADH得率的影响，得出最佳提取条件。实验结果表明，乙醚化学渗透法提取 NADH的最佳条件是：酵母细胞浓度 010 g／Inl，酵母细胞悬液与乙醚体积比为1：4，提取时间20Illln。建立了乙醚化学渗透法NADH释放的动力学模型。用化学渗透法处理酵母细胞，NADH的得率明显高于机械裂解法。2．亲和层析法分离和纯化NAD 使用酵母醇脱氢酶作为亲和配体，将YADH和CNBr活化的SePharose 4B偶连，制备固定化脱氢酶柱来分离和纯化 NADH。当乙醇脱氢酶的用量从 16mg／gCNBrsepharose 4B 加大到60rn驼CNBrsePharose 4B时，其与 CNBr－Sepharose 4B的偶联率从95％下降到68．2％，己结合酶活性相对游离态从25％下降到9．5％。当流速从0．SInl／ndn加快到4．SInljndn时，亲和柱结合NADH的量也从1．48mg下降到1二mg。3．亲和超滤法分离和纯化NADH 酵母细胞化学渗透液含有NADH、ATP、NAD和其它辅酶等许多小分子物质，选用YADH作为亲和配体，在PH 8刀，离子强度为01mOW时，用YADH把细胞渗透液中的NADH分离出来。使用 MWCO＝30000的滤膜超滤，NADH－YADH复合物留在截留液中，从而与其它小分子物质分离。改变PH值和离子强度，NADH－YADH复合物解离，通过超滤，NADH分离到滤过液中，YADH作为截留而回收，回收率达93％，活性损失15％。结论： 二 使用化学渗透法处理酵母细胞，用亲和超滤纯化可获得高的NAD产率。该方法和以前的方法如：亲和层析法相比具有简单、经济、省时、高效等特点，且容易放大。本研究为高效提取、纯化NADH提供了一个行之有效的新方法。