EPO对窒息新生鼠内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP及其介导的心肌细胞凋亡的影响

目的：1．采用窒息新生鼠模型，观察新生鼠窒息后心肌损伤及心肌细胞凋亡情况。2．研究新生鼠缺氧缺血性心肌损伤过程中是否存在ERS和CHOP凋亡通路的激活及其与心肌细胞凋亡的关系。3．研究EPO对窒息新生鼠缺氧缺血性心肌损伤以及心肌组织GRP78、CHOP蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法：1．实验分组及新生鼠常压窒息模型制作：120只新生7日龄SD大鼠按完全随机分组分为以下3组（每组n=40）：假手术组、窒息组、EPO组；每组再分为2h、6h、12h、24h、48h五个时间点（每时间点8只）。窒息组和EPO组制备新生鼠常压窒息模型，假手术组仅进行模拟常压窒息过程，不塞瓶塞、复氧，EPO组于造模完成后立即给予rhEPO10ml/kg（500U/ml）腹腔注射，其余两组接受同剂量的生理盐水（0.9%）。各组在造模完成后分别于各时间点取血及心肌组织，进行各项指标的检测。2．观察指标：血清心肌酶CK、LDH水平；HE染色观察心肌组织病理形态学改变；TUNEL法定性和定量检测心肌细胞凋亡；免疫组织化学染色法测定心肌组织GRP78、CHOP蛋白表达。3．数据分析：采用SPSS19.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（x±ｓ）表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著。心肌组织CHOP表达与心肌细胞凋亡指数的相关分析，采用Pearson相关分析。结果：1．血清心肌酶CK水平：与假手术组比较，窒息组、EPO组各时间点CK值均显著升高(P<0.01)，2h开始升高，6h、12h、24h、48h逐渐增加；与窒息组比较，EPO组各时间点CK值均显著下降(P<0.01)。2．血清心肌酶LDH水平：与假手术组比较，窒息组、EPO组各时间点LDH值均显著升高(P<0.01)，2h开始升高，6h、12h、24h、48h逐渐增加；与窒息组比较，EPO组各时间点LDH值均显著下降(P<0.01)。3．心肌组织病理改变：与假手术组比较，窒息组各时间点心肌细胞排列紊乱，细胞核不规则，呈浓缩状，心肌间质充血水肿，有炎性细胞浸润；EPO组心肌细胞排列紊乱、间质充血水肿、炎性细胞浸润均比同时间点窒息组减轻。4．心肌细胞凋亡荧光显色：假手术组仅见少量凋亡细胞荧光显色；窒息组凋亡细胞明显增多；EPO组凋亡细胞较窒息组减少，但多于假手术组。5．心肌细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）结果分析：与假手术组比较，窒息组、EPO组各时间点AI均显著升高(P<0.01)，2h开始升高，6h、12h、24h、48h逐渐增加；与窒息组比较，EPO组各时间点AI均显著下降(P<0.01)。6．心肌组织GRP78蛋白表达：与假手术组比较，窒息组、EPO组各时间点GRP78蛋白表达均显著升高(P<0.01)，2h开始升高，12h达高峰，48h仍高于正常；与窒息组比较，EPO组各时间点GRP78蛋白表达均显著下降(P<0.01)。7．心肌组织CHOP蛋白表达：与假手术组比较，窒息组、EPO组各时间点CHOP蛋白表达均显著升高(P<0.01)，2h开始升高，24h达高峰，48h仍高于正常；与窒息组比较，EPO组各时间点CHOP蛋白表达均显著下降(P<0.01)。8．心肌组织CHOP表达与AI之间进行相关性分析：心肌组织CHOP表达与心肌细胞凋亡指数于窒息后2h、6h、12h、24h四个时间点分别成正相关，于48h无直线相关关系。结论：1．新生大鼠窒息后早期心肌细胞即可出现一定程度的损伤及凋亡，且在48h内持续升高。2．新生鼠窒息所致缺氧缺血性心肌损伤过程中存在ERS及CHOP凋亡信号通路的激活。3．窒息新生鼠心肌细胞凋亡与CHOP凋亡信号通路的激活有关。4．EPO通过减轻ERS、干扰CHOP凋亡信号通路、减少心肌细胞凋亡，从而发挥对新生鼠缺氧缺血性心肌损伤的保护作用。