BDNF转基因成纤维细胞移植促进脊髓可塑性的分子信号通路研究

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目的建立准确而可靠的成年大鼠脊髓完全横断损伤模型。构建大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰的成纤维细胞(FB)。将BDNF基因修饰的FB移植入损伤脊髓内,探讨其对大鼠运动功能的影响及其对分子信号通路的调节。方法建立脊髓全横断损伤(SCT)模型,不同时间点进行BBB评分、体感诱发电位、运动诱发电位以及病理学检查验证模型可靠性。建模成功后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体LipofectamineTM 2000介导转染FB,应用免疫细胞化学和western blot鉴定BDNF在细胞内的表达,并验证BDNF的生物活性。将BDNF转基因FB用Hoechst33342标记后移植入损伤脊髓,评价BDNF转基因FB对动物行为学的影响;荧光显微镜观测FB或BDNF-FB在体内存活、分布情况;应用免疫组化技术检测损伤脊髓节段中BDNF的表达。用RT-PCR技术检测BDNF相关信号通路分子cyclin D1、Cyclin E、CDK、Bad、bcl-xl、CREB、p90rsk以及Stat3在脊髓与腓肠肌中的表达。结果通过BBB评分、皮层体感诱发电位和运动诱发电位检测证明脊髓完全横断,证明SCT建模成功。RT-PCR确定BDNF基因产物为749bp的特异片段,构建于5.4kb的质粒pcDNA3经DNA测序验证,并成功构建于pcDNA3/BDNF重组质粒载体。将其转染FB后,免疫细胞化学、western blot结果表明BDNF在FB过表达;且具有促进PC12细胞生长的活性。BDNF转基因细胞移植入体内后,荧光显微镜下均见到移植细胞在损伤脊髓存活。BDNF-FB组大鼠BBB评分高于其它两组(P<0.01)。说明BDNF转基因细胞移植促进SCT大鼠运动功能恢复。免疫组化学检测显示BDNF在脊髓大量表达。且脊髓cdk4和CyclinDl的基因表达在BDNF-FB组比对照组减少(P<0.05);BDNF-FB组肌肉组织内CREB的表达也比其它两组减少(P<0.05)。而BDNF-FB组肌肉组织内CyclinDl的表达则比其它两组增加(P<0.05)。结论BDNF基因修饰的FB移植后可在脊髓损伤处存活,表达BDNF蛋白,并促进神经功能的恢复。其分子机制与脊髓和肌肉CvclinD1、cdk4、CREB等分子信号通路调节有关。
中文摘要第5-7页
英文摘要第7-9页
英文缩写词表第10-11页
研究背景第11-19页
    参考文献第14-19页
论文第一部分 大鼠脊髓全横断模型建立第19-40页
    引言第19-20页
    材料方法第20-27页
    结果第27-29页
    讨论第29-34页
    参考文献第34-40页
论文第二部分 BDNF转基因成纤维细胞的构建与检测第40-81页
    引言第40-42页
    材料方法第42-70页
    结果第70-74页
    讨论第74-76页
    参考文献第76-81页
论文第三部分 BDNF基因修饰的成纤维细胞对全横断脊髓损伤大鼠运动功能的影响及其分子信号通路的调节第81-122页
    引言第81-83页
    材料方法第83-102页
    结果第102-107页
    讨论第107-113页
    参考文献第113-122页
结论第122-123页
综述1 脊髓损伤动物模型的研究进展第123-143页
    参考文献第135-143页
综述2 PDGF和BDNF及其与神经系统关系的研究进展第143-157页
    参考文献第151-157页
致谢第157-158页
博士在读期间发表论文第158-159页
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