水稻耐汞基因的QTL分析及耐汞相关基因OsPP2C功能的初步研究

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汞是植物生长的非必需元素,同时也是毒性最强的重金属之一,目前汞污染已经成为世界性的环境污染问题,引起人们广泛关注。为了研究植物的耐汞机制,本研究以粳稻越富和IRAT109为实验材料,对其进行QTL分析;以9311和Azucena为实验材料,使用定量PCR的方法分析HgCl2胁迫下蛋白磷酸酶OsPP2C基因的表达,利用原核表达技术初步分析耐汞相关基因OsPP2C的功能。主要研究结果如下:1.采用不同浓度0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μM HgCl2处理4d苗龄的水稻幼苗3d,分别测定其最长根长,以相对根长(RRL)为指标评估越富和IRAT109的耐汞性差异。结果表明,当使用1.0μM和1.5μM HgCl2处理时,越富的耐汞性极显著强于IRAT109(P<0.01),浓度为1.5μM时二者差异最大。2.利用1.5μM HgCl2处理越富和IRAT109杂交获得的RILs群体的120个株系3d,以RRL为指标,进行耐汞性QTL分析。共检测到3个耐汞性相关的QTLs,分别位于1、2、5号染色体上,解释表型变化的11.0%、10.8%和13.9%。3.用15μM的Hg2+胁迫处理9311和Azucena5叶期幼苗14d。结果显示,Hg2+能抑制9311和Azucena的生长,影响干重的积累,但9311和Azucena对Hg2+胁迫的耐性有所不同,9311对Hg2+胁迫的耐性显著强于Azucena。4.大量研究显示,蛋白磷酸酶PP2C在植物抗逆过程中起着重要的作用。本文在实验室前期研究的基础上利用实时定量PCR的方法,分析了水稻根部OsPP2C基因在Hg2+胁迫下的表达。结果显示,Hg2+胁迫下,9311中OsPP2C基因在处理3h、6h和9h的表达极显著高于Azucena的。5.将克隆的OsPP2C基因导入大肠杆菌进行原核表达分析,使用Hg2+胁迫处理含空载体pET24a和含重组质粒pET24a-OsPP2C的大肠杆菌,结果显示OsPP2C基因能增强大肠杆菌对Hg2+对汞的耐性。
摘要第5-7页
ABSTRACT第7-8页
缩略词表第9-15页
第一部分 文献综述第15-29页
    第一章 汞毒害作用及植物耐汞毒害的机制第15-20页
        1 前言第15-16页
        2 汞对植物生长发育的影响第16-17页
        3 植物耐汞胁迫的生理机制第17-18页
            3.1 激活体内的抗氧化系统第17-18页
            3.2 细胞器的区域化作用及有机物的螯合作用第18页
        4 植物耐汞胁迫的分子机制第18-20页
    第二章 数量性状QTL(quantitative trait loci)概述第20-25页
        1 QTL定位的原理第20页
        2 遗传连锁图谱的构建第20-21页
            2.1 亲本的选择第20页
            2.2 QTL作图群体第20-21页
        3 QTL定位的分析方法第21页
        4 影响QTL定位的因素第21-22页
        5 QTL的精细定位与克隆第22-23页
        6 QTL定位在水稻重金属离子胁迫中的应用第23-25页
    第三章 植物蛋白磷酸酶PP2C功能的研究进展第25-29页
        1 蛋白磷酸酶的分类第25页
        2 植物蛋白磷酸酶PP2C第25-26页
        3 植物PP2C与抗逆第26-27页
        4 植物PP2C研究的意义第27页
        5 本课题研究的意义第27-28页
        6 技术路线第28-29页
            6.1 水稻耐汞性状的QTL分析第28页
            6.2 耐汞相关基因OsPP2C功能的研究第28-29页
第二部分 研究论文第29-66页
    第一章 水稻苗期耐汞QTLs的分析第29-36页
        1 前言第29页
        2 实验材料与方法第29-31页
            2.1 实验材料第29-30页
            2.2 实验方法第30-31页
                2.2.1 种子的萌发与培养第30页
                2.2.2 汞耐性的评估第30页
                2.2.3 群体种子的胁迫处理第30页
                2.2.4 分子图谱的构建和QTL分析第30-31页
        3 实验结果第31-34页
            3.1 越富和IRAT109耐汞性差异第31页
            3.2 表型表现第31-32页
            3.3 耐汞QTLs的检测第32-34页
        4 分析与讨论第34-36页
    第二章 HgCl_2胁迫下9311和Azucena耐性比较分析第36-41页
        1 前言第36页
        2 材料与方法第36-37页
            2.1 实验材料第36页
            2.2 实验方法第36-37页
                2.2.1 种子的萌发与培养第36-37页
                2.2.2 幼苗生长指标的测定第37页
                2.2.3 汞含量的测定第37页
        3 实验结果第37-40页
            3.1 HgCl_2处理浓度的确定第37-38页
            3.2 HgCl_2胁迫对水稻幼苗相对根长(根干重)和相对苗高(苗干重)的影响第38-39页
            3.3 水稻幼苗根和地上部分汞含量分析第39-40页
        4 分析第40-41页
    第三章 OsPP2C基因的克隆及汞胁迫下的表达分析第41-55页
        1 前言第41-42页
        2 材料与方法第42-47页
            2.1 实验材料及培养第42页
                2.1.1 实验材料第42页
                2.1.2 实验材料的培养第42页
            2.2 RNA提取第42-43页
            2.3 双链cDNA的合成第43-44页
                2.3.1 第一链cDNA合成第43-44页
                2.3.2 第二链cDNA合成第44页
            2.4 实时定量PCR第44-47页
                2.4.1 引物的设计第44-45页
                2.4.2 定量PCR片段的扩增第45页
                2.4.3 PCR扩增产物的检测第45页
                2.4.4 PCR扩增产物的回收和纯化第45页
                2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备第45-46页
                2.4.6 目的片段的连接第46页
                2.4.7 连接产物的转化、蓝白斑筛选、菌落PCR检测及菌液保存第46页
                2.4.8 序列测定第46页
                2.4.9 实时定量PCR分析OsPP2C基因的表达第46-47页
        3 OsPP2C基因的克隆第47-49页
            3.1 OsPP2C基因cDNA全长克隆第47-48页
            3.2 OsPP2C基因组全长克隆第48-49页
            3.4 PCR扩增产物序列的测定第49页
        4 实验结果第49-53页
            4.1 HgCl_2胁迫下水稻幼苗根中OsPP2C基因的表达第49-50页
            4.2 OsPP2C基因cDNA全长第50-51页
            4.3 OsPP2C基因组DNA全长第51页
            4.4 水稻OsPP2C基因序列结构分析第51-53页
        5 讨论第53-55页
    第四章 OsPP2C基因的原核表达及功能分析第55-66页
        1 前言第55页
        2 材料与方法第55-61页
            2.1 实验材料第55页
            2.2 技术与方法第55-61页
                2.2.1 引物的设计与合成第55-56页
                2.2.2 质粒的提取第56页
                2.2.3 OsPP2C基因的克隆第56-57页
                2.2.4 PCR扩增产物检测第57页
                2.2.5 PCR扩增产物的回收与纯化第57页
                2.2.6 原核表达载体的构建第57-58页
                2.2.8 大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)的制备第58页
                2.2.9 表达载体pET-24a-OsPP2C转化入BL21(DE3)感受态细胞第58页
                2.2.10 重组大肠杆菌的鉴定第58-59页
                2.2.11 OsPP2C基因在大肠杆菌中的诱导表达第59页
                2.2.12 SDS-PAGE检测融合蛋白表达第59-60页
                2.2.13 聚丙烯酰胺凝胶的染色及脱色第60页
                2.2.14 HgCl_2胁迫对大肠杆菌生长的影响第60-61页
                2.2.15 大肠杆菌汞含量的测定第61页
        3 实验结果第61-64页
            3.1 原核表达载体pET-24a-OsPP2C的构建第61-62页
            3.2 重组载体pET-24a-OsPP2C在大肠杆菌中的表达第62页
            3.3 重组大肠杆菌对不同浓度汞离子耐性的比较分析第62-63页
            3.4 大肠杆菌汞含量分析第63-64页
        4 讨论第64-66页
参考文献第66-75页
致谢第75-76页
攻读学位期间发表的学术论文第76-77页
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