第一部分紫杉醇联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对前列腺癌细胞株的抑制作用研究目的重组的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导包括前列腺癌在内的多种肿瘤细胞凋亡,但易出现耐药性,探讨TRAIL联合紫杉醇对前列腺癌细胞株LNCAP、Du145、PC3的抑制作用。方法MTT法测定紫杉醇、TRAIL、及紫杉醇联合TRAIL作用于LNCAP、DU145、PC3细胞后24h、48h、72h的生存率,在同一时间点,用流式细胞技术测定3种细胞的凋亡率。结果(1)2ng/mL TRAIL对LNCAP细胞有明显的抑制作用,生存率在作用24h后(75.15±3.73)%,48h(66.93±2.90)%,72h下降达(26.51±2.00)%,呈明显的时间依赖性。2ng/mL TRAIL对PC3细胞抑制作用较轻,作用24h、48h、72h后生存率分别为(87.92±3.65)%、(70.54±3.43)%、(84.51±3.28)%。相同浓度的TRAIL对DU 145细胞的抑制作用不明显,生存率48h为(92.69±3.82)%、72h为(99.75±1.86)%。当2ng/mL TRAIL联合25nmol/ml紫杉醇则对LNCAP、DU 145、PC3细胞均有明显的抑制作用,72h抑制作用最强,3种细胞的生存率分别降低到(19.56±1.72)%、(41.24±1.84)%、(29.06±2.84)%,与单用TRAIL组比较差异具显著性意义,P<0.01。(2)TRAIL对LNCAP、DU 145、PC3细胞均有诱导凋亡作用,5ng/mL TRAIL作用24h后3种癌细胞凋亡率分别为52.81±3.70、21.68±1.48、35.21±2.00,而2ng/mL TRAIL作用24h后3种癌细胞凋亡率分别为22.34±1.98、14.34±2.23、30.08±3.36,两者比较,前者诱导凋亡作用更强,差异具有显著性意义,P<0.01,并呈一定的量效关系。(3)2ng/mL TRAIL联合25nmol/ml紫杉醇明显增强诱导LNCAP、DU 145、PC3 3种细胞凋亡作用,在24h、48h、72h各时间点,凋亡率明显高于单独用紫杉醇或TRAIL组,差异具有显著性意义,P<0.01。结论TRAIL与紫杉醇联合应用较单独用TRAIL或紫杉醇能明显增强对LNCAP、DU145、PC3癌细胞的抑瘤效应和诱导凋亡作用,且呈明显的时间效应和一定的量效关系。第二部分紫杉醇联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对人前列腺癌原代细胞的抑制作用目的探讨TRAIL联合紫杉醇对人前列腺癌原代细胞的抑制作用。方法从临床得到新鲜人前列腺癌组织标本21例,分离制备得到人前列腺癌原代细胞。MTT法测定紫杉醇、TRAIL、及紫杉醇联合TRAIL作用于人前列腺癌原代细胞6h、12h、24h后的生存率。结果①5ng/mL TRAIL作用于人前列腺癌原代细胞6h后,细胞生存率轻度减低,为(90.30±6.04)%,12h为(82.41±6.88)%,24h为(73.31±7.50)%,呈时间依赖性效应,各时间点比较,差异具有显著性意义,P<0.01。②紫杉醇25nmol/ml的抑瘤效果也呈时间依赖性,作用6h、12h、24h后,人前列腺癌原代细胞生存率分别为(85.97±6.26)%、(75.28±7.16)%、(57.38±6.91)%,组间比较,差异均有显著性意义,P<0.01。③5ng/ml TRAIL联合紫杉醇25nmol/ml应用,抑制人前列腺癌原代细胞增殖的作用显著增强,作用6h、12h、24h后,其生存率分别是(79.87±6.22)%、(68.81±7.13)%、(49.39±6.49)%,与单独用TRAIL、紫杉醇的抑制作用比较,差异具显著性意义P<0.01,且联合抑瘤作用呈时间依赖性效应,24h的抑制作用最强。结论5ng/ml TRAIL与紫杉醇25nmol/ml联合应用能明显增强对人前列腺癌原代细胞的抑瘤效果。第三部分紫杉醇联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对前列腺癌细胞抑制作用的机制研究目的:探讨紫杉醇与TRAIL联合应用增强抑制前列腺癌细胞的作用及其机制。方法:用MTT法分别检测2ng/ml TRAIL、25nmol/ml紫杉醇、及二者联合作用JURKART、LNCAP、DU 145、PC3癌细胞株48h后细胞的生存率。用RT-PCR方法检测4种癌细胞TRAIL-R2 mRNA、Caspase-3 mRNA的表达。用Western blot检测25nmol/mL紫杉醇作用DU 145细胞2、4、6、8、12、24h后其TRAIL-R2、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平。结果:1. 2ng/ml TRAIL、25nmol/ml紫杉醇分别作用于JURKART、LNCAP、PC3细胞48h后,细胞增殖均出现抑制,而TRAIL和紫杉醇联合应用则抑制效果明显增强,P<0.01。2ng/ml TRAIL单独作用DU 145细胞未出现明显抑制,生存率(94.86±4.18)%。但是DU145细胞先用25nmol/ml紫杉醇作用24h,再用2ng/ml TRAIL作用24h,细胞出现明显的增殖抑制,其生存率减低为(41.63±3.39)%。2.在25nmol/ml紫杉醇作用JURKART、LNCAP、DU145、PC3细胞前,作用24h后,TRAIL-R2 mRNA均呈明显表达;JURKART、LNCAP、PC3细胞的Caspase-3 mRNA在紫杉醇作用前后也呈明显表达;而紫杉醇作用前DU 145细胞Caspase-3 mRNA无明显表达,但在紫杉醇作用24h后则Caspase-3 mRNA表达增加。3. 25nmol/ml紫杉醇作用Du 145细胞2、4、6、8、12、24h,TRAIL-R2蛋白表达的变化不明显,bcl-2蛋白表达逐渐减低,Caspase-3蛋白的表达逐渐增强,各时间点间比较,差异具显著性意义,P<0.01。结论:紫杉醇预先作用DU 145细胞24h后,可以明显增强2ng/ml TRAIL对细胞的增殖抑制作用,紫杉醇可能是通过下调抗凋亡基因bcl-2,增强Caspase-3表达,从而提高前列腺癌细胞对TRAIL的敏感性,TRAIL联合紫杉醇应用可以增强前列腺癌细胞的抑癌效应。
