喜树内生真菌及其次级代谢产物的研究

喜树碱作为特异性DNA拓扑异构酶抑制剂,是一种具有良好抗癌效果的有效成分。但是由于其在喜树植物中含量极低,提取困难,而且结构复杂,难以通过化学合成的方法得到。因此,植物内生真菌作为喜树碱新型的药用资源已引起了广泛的关注。本文从喜树树皮中共分离得到约50株内生真菌。以喜树碱标准品为对照,利用薄层色谱、紫外分光光度法以及高效液相色谱法,筛选出一株产喜树碱的内生菌株EFC I-13。通过形态学鉴定,将其归为青霉属。为了提高喜树碱的产量,对菌株EFC I-13的发酵培养基进行了优化。通过单因素实验选定的最佳碳源为葡萄糖,氮源为酵母膏和硫酸铵。Plackett-Burman实验表明影响喜树碱的主要因素为葡萄糖,磷酸二氢钾和L-色氨酸。最陡爬坡实验确定了这些主要因素的零点值。通过Box-Behnken实验和响应面分析,得到最佳发酵培养基为葡萄糖10.48g/L,磷酸二氢钾2.91g/L,L-色氨酸0.148g/L,酵母膏15g/L,硫酸镁0.5 g/L,硫酸铵0.8 g/L,氯化钙0.1 g/L,在此条件下喜树碱的最大产量为80.41μ/L。经过实验验证,在该培养基条件下,喜树碱产量达80.39μg/L,比优化培养基前的产量提高了43.9%。随机选择了36对PCR-SRAP引物对喜树内生真菌进行研究,筛选出了6对稳定性好,扩增条带多的引物组合。这6对引物组合共扩增出425条条带,其中365条为多态性条带,多态性条带的比例为85.9%。在相似系数为0.54时,菌株可分为三大类。说明了SRAP方法可用于喜树内生真菌的多态性分析。