喜树内生真菌及其次级代谢产物的研究

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喜树碱作为特异性DNA拓扑异构酶抑制剂,是一种具有良好抗癌效果的有效成分。但是由于其在喜树植物中含量极低,提取困难,而且结构复杂,难以通过化学合成的方法得到。因此,植物内生真菌作为喜树碱新型的药用资源已引起了广泛的关注。本文从喜树树皮中共分离得到约50株内生真菌。以喜树碱标准品为对照,利用薄层色谱、紫外分光光度法以及高效液相色谱法,筛选出一株产喜树碱的内生菌株EFC I-13。通过形态学鉴定,将其归为青霉属。为了提高喜树碱的产量,对菌株EFC I-13的发酵培养基进行了优化。通过单因素实验选定的最佳碳源为葡萄糖,氮源为酵母膏和硫酸铵。Plackett-Burman实验表明影响喜树碱的主要因素为葡萄糖,磷酸二氢钾和L-色氨酸。最陡爬坡实验确定了这些主要因素的零点值。通过Box-Behnken实验和响应面分析,得到最佳发酵培养基为葡萄糖10.48g/L,磷酸二氢钾2.91g/L,L-色氨酸0.148g/L,酵母膏15g/L,硫酸镁0.5 g/L,硫酸铵0.8 g/L,氯化钙0.1 g/L,在此条件下喜树碱的最大产量为80.41μ/L。经过实验验证,在该培养基条件下,喜树碱产量达80.39μg/L,比优化培养基前的产量提高了43.9%。随机选择了36对PCR-SRAP引物对喜树内生真菌进行研究,筛选出了6对稳定性好,扩增条带多的引物组合。这6对引物组合共扩增出425条条带,其中365条为多态性条带,多态性条带的比例为85.9%。在相似系数为0.54时,菌株可分为三大类。说明了SRAP方法可用于喜树内生真菌的多态性分析。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4页
第一章 文献综述第8-20页
    1.1 喜树概述第8-9页
        1.1.1 喜树植物概述第8页
        1.1.2 喜树化学成分第8-9页
    1.2 内生真菌概述第9-13页
        1.2.1 内生真菌的定义第9-10页
        1.2.2 内生真菌的应用第10-11页
        1.2.3 喜树内生真菌第11-13页
    1.3 植物内生真菌次级代谢产物概述第13-17页
        1.3.1 黄酮类化合物第13-14页
        1.3.2 醌类化合物第14页
        1.3.3 甾体类化合物第14-15页
        1.3.4 萜类化合物第15页
        1.3.5 生物碱类化合物第15-16页
        1.3.6 其它类第16-17页
    1.4 SRAP概述第17-19页
        1.4.1 SRAP的原理及特点第17-18页
        1.4.2 遗传多态性及亲缘关系研究第18页
        1.4.3 种质资源鉴定评价第18页
        1.4.4 遗传连锁图谱构建第18页
        1.4.5 其它应用第18-19页
    1.5 本课题研究背景及内容第19-20页
第二章 产喜树碱喜树内生真菌的筛选第20-33页
    2.1 材料与仪器第20-21页
        2.1.1 材料第20页
        2.1.2 培养基第20页
        2.1.3 试剂第20-21页
        2.1.4 仪器第21页
    2.2 内生真菌的分离纯化第21-22页
        2.2.1 内生真菌的分离第21页
        2.2.2 内生真菌的纯化第21-22页
    2.3 内生真菌次级代谢产物提取第22页
        2.3.3 内生真菌的培养第22页
        2.3.4 内生真菌产物提取第22页
    2.4 目标菌株的筛选第22-23页
        2.4.1 薄层层析鉴定第22-23页
        2.4.2 紫外分光光度检测第23页
        2.4.3 高效液相色谱分析第23页
    2.5 结果与讨论第23-29页
        2.5.1 内生真菌的分离纯化结果第23页
        2.5.2 薄层层析鉴定结果第23-26页
        2.5.3 紫外分析结果第26-27页
        2.5.4 高效液相分析结果第27-28页
        2.5.5 讨论第28-29页
    2.6 目标菌株的生物学特性第29-32页
        2.6.1 目标菌株的培养第29页
        2.6.2 显微形态特征的观察第29-30页
        2.6.3 发酵特征的观察第30页
        2.6.4 结果与讨论第30-32页
    2.7 本章小结第32-33页
第三章 产喜树碱内生真菌发酵培养基的优化第33-46页
    3.1 材料与仪器第33页
        3.1.1 内生真菌第33页
        3.1.2 培养基第33页
        3.1.3 试剂第33页
        3.1.4 仪器第33页
    3.2 发酵培养基的优化第33-36页
        3.2.1 碳源种类对喜树碱产量的影响第34-35页
        3.2.2 氮源种类对喜树碱产量的影响第35页
        3.2.3 Plackett-Burman实验设计第35页
        3.2.4 最陡爬坡实验设计第35-36页
        3.2.5 Box-Behnken实验设计第36页
    3.3 结果与讨论第36-45页
        3.3.1 碳源对喜树碱含量的影响第36-37页
        3.3.2 氮源对喜树碱含量的影响第37-38页
        3.3.3 Plackett-Burman实验设计结果第38-40页
        3.3.4 最陡爬坡实验设计结果第40-41页
        3.3.5 Box-Behnken实验结果第41-45页
    3.4 本章小结第45-46页
第四章 喜树内生真菌的SRAP分析第46-57页
    4.1 材料与仪器第46-47页
        4.1.1 菌种第46页
        4.1.2 培养基第46页
        4.1.3 试剂第46-47页
        4.1.4 仪器第47页
        4.1.5 引物第47页
    4.2 菌种培养及DNA提取第47-49页
        4.2.1 菌种培养及提取方法第47-49页
        4.2.2 菌株DNA提取与检测第49页
    4.3 喜树内生真菌基因组SRAP-PCR扩增第49-50页
        4.3.1 SRAP-PCR扩增条件第49-50页
        4.3.2 SRAP-PCR扩增产物检测第50页
    4.4 SRAP-PCR扩增数据分析第50-51页
        4.4.1 SRAP反应引物筛选第50-51页
        4.4.2 SRAP数据分析第51页
    4.5 喜树内生真菌SRAP方法结果与讨论第51-56页
        4.5.1 DNA提取检测第51页
        4.5.2 SRAP多态性第51-52页
        4.5.3 喜树内生真菌SRAP标记的遗传多样性分析第52-55页
        4.5.4 讨论第55-56页
    4.6 本章小结第56-57页
第五章 总结与展望第57-59页
参考文献第59-67页
致谢第67-68页
攻读学位期间主要的研究成果及奖励第68页
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