扩展青霉菌PCR快速检测方法研究

扩展青霉菌是引起苹果腐烂的主要真菌之一，是棒曲霉素的主要产生菌。棒曲霉素是一种致畸致癌的真菌毒素，国际上对食品中，尤其是果汁中的棒曲霉素含量有明确的规定。要达到控制棒曲霉素的产生量，应该从根本上控制扩展青霉的生长，最直接的方法就是对其进行检测并进行控制。传统的检测扩展青霉素菌的方法主要是培养法，进行形态学的鉴定，耗时且受主观因素影响，不能达到快速检测的目的，这就要求我们寻找一种新的检测方法。近些年来，随着PCR技术在微生物检测方面的发展和应用，其快速准确的特点使其在该方面具有明显的优势，而PCR技术的基础则是基因组DNA的提取。因此，从检测棒曲霉素的产生菌—扩展青霉的检测入手，尽可能的减少产品中该产毒菌，从而减少棒曲霉素的产生，对提高苹果汁的质量有着重要的意义。本研究以棒曲霉素产生菌—扩展青霉为原材料，通过比较5种常用的提取真菌DNA的方法，从而得到最适合扩真情霉菌基因组DNA的提取方法，然后基于PCR检测技术的特点，设计适合于该菌的特异性引物，并优化PCR扩增反应的条件，得到一组适合于扩展青霉菌DNA进行PCR检测的扩增参数，为实际应用和后期发展提供理论依据和基础研究。本研究获得的主要结论有：（1）通过对5种常用的提取真菌DNA的方法及其提取扩展青霉菌的效果，及所提DNA是否适合于后续的分子生物学研究进行比较，得知，氯化苄法是最适合于扩展青霉菌基因组DNA的提取方法，并能满足后续研究的进行。（2）对PCR扩增反应条件进行优化，得到的适合于扩展青霉菌扩增的最佳反应体系为：退火温度57℃，引物浓度为0.40μmol/L，模板DNA质量浓度为8μg/mL。（3）通过特异性和灵敏性试验得知，该反应体系能够特异的扩增出扩展青霉菌，扩增出的目的条带为288bp，该体系能够检测到的最低的DNA浓度为0.1μg/mL，克隆测序结果显示与扩展青霉菌的聚多半乳糖醛酸酶的部分序列同源性达到94%。本研究结果显示该方法能够快速、特异地检测出扩展青霉菌，为控制扩展青霉的生长，从而防止棒曲霉素污染超标提供了一个有效的理论指导，该方法可以用于商业对苹果及苹果汁中感染扩展青霉的检测。