Th17细胞在人脑出血中的作用及其机制研究

脑出血是神经系统危重症之一，严重影响人类的健康和患者的生存质量。而目前脑出血治疗缺乏特异有效手段，其原因主要是脑出血后血肿周围组织损伤机制尚未完全阐明。大量研究证实炎症反应参与脑出血后的病理过程。本研究以脑出血患者外周血及血肿周围组织为研究对象，探讨Th17细胞在人脑出血中的作用及其机制。研究共分为三部分：1、选取脑出血患者48例，分别于患者发病后≤6h、6-24h、24-72h和>72h采外周血，采用ELISA法检测脑出血患者外周血中IL-17，IL-23和IFN-γ的水平，RT-PCR法检测患者外周血单个核细胞中TIM-3mRNA的表达。探讨IL-17，IL-23，IFN-γ和TIM-3mRNA在脑出血患者外周血中的表达及作用。≤6h组患者外周血中IL-17的水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05），6-24h组、24-72h组和>72h组均显著增加（P<0.05）。24-72h组患者外周血中IL-17的水平显著高于≤6h组、6-24h组和>72h组（P<0.05）。≤6h组、6-24h组、24-72h组和>72h组患者外周血中IL-23的水平与对照组相比均显著增加（P<0.05）。6-24h组患者外周血中IL-23的水平显著高于≤6h组、24-72h组和>72h组（P<0.05）。≤6h组、6-24h组、24-72h组和>72h组患者外周血中IFN-γ的水平与对照组相比均显著增加（P<0.05）。24-72h组患者外周血中IFN-γ的水平显著高于≤6h组、6-24h组和>72h组（P<0.05）。≤6h组、6-24h组、24-72h组和>72h组患者外周血中TIM-3mRNA的表达与对照组相比均显著增加（P<0.05）。2、选取脑出血行血肿清除术的患者24例，按发病到获取标本的时间间隔分为4组，≤6h组、6-24h组、24-72h组和>72h组。取靠近血肿旁1cm左右脑组织作为实验组，将入路中远离血肿处的脑组织作为对照组。HE染色观察脑出血血肿周围组织的病理变化，免疫组化染色观察脑出血血肿周围组织IL-17和TIM-3的蛋白表达，RT-PCR法检测IL-17mRNA和TIM-3mRNA的表达，并将其进行相关性分析，探讨Th17细胞在人脑出血血肿周围组织炎症反应中作用及机制。HE染色：≤6h组，血肿周围脑组织病理改变与对照组相似，偶见散在炎性细胞浸润。6-24h组，血肿周围脑组织轻度损伤，可见神经元及纤维水肿。部分神经元变性，形态不完整，细胞数目略减少，可见核固缩。散在炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，可见淋巴细胞。病灶周围微血管充血，扩张。24-72h组，血肿周围脑组织损伤最重，神经元及纤维水肿明显，较多神经元形态不完整及数目减少，细胞核固缩明显。炎性细胞浸润明显，可见大量中性粒细胞及淋巴细胞，伴少量胶质细胞增生。>72h组，血肿周围脑组织损伤较前略减轻，炎性细胞浸润减少，但仍可见少量淋巴细胞，胶质细胞增生明显。免疫组化染色：≤6h组，血肿周围组织IL-17水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05），6-24h组、24-72h组和>72h组，IL-17的水平显著增加（P<0.05）。24-72h组血肿周围组织IL-17的水平显著高于≤6h组、6-24h组和>72h组（P<0.05）。≤6h组，血肿周围组织TIM-3的水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05），6-24h组、24-72h组和>72h组，血肿周围组织TIM-3的水平显著增加（P<0.05）。24-72h组血肿周围脑组织TIM-3的水平显著高于≤6h组、6-24h组和>72h组（P<0.05）。RT-PCR：IL-17mRNA和TIM-3mRNA的表达趋势与其免疫组化染色结果一致。相关性分析：脑出血血肿周围组织IL-17水平与TIM-3的水平为正相关（r=0.627，P <0.01）。3、应用Western blot和免疫组化染色检测脑出血血肿周围组织NF-κBp65的表达。将IL-17与NF-κBp65进行相关性分析，探讨IL-17/NF-κBp65通路在脑出血血肿周围组织炎性反应中的作用机制。免疫组化染色：≤6h组、6-24h组、24-72h组和>72h组血肿周围组织NF-κBp65的水平与对照组相比均显著增加（P<0.05）。24-72h组血肿周围组织NF-κBp65的水平显著高于≤6h组、6-24h组和>72h组（P<0.05）。Western blot：NF-κBp65核蛋白的表达趋势与NF-κBp65免疫组化结果一致。相关性分析：脑出血血肿周围组织IL-17水平与NF-κBp65的水平为正相关（r=0.719，P <0.01）。结论：1脑出血发病6h后，患者外周血中IL-17水平增加。2脑出血发病6h内，患者外周血中IL-23和IFN-γ水平就开始增加。3脑出血患者外周血单个核细胞TIM-3mRNA表达增高。4脑出血发病6h后，血肿周围脑组织IL-17和TIM-3的表达增高，TIM-3可能通过调控IL-17的分泌，促进炎症反应。5脑出血血肿周围脑组织NF-κBp65表达增高，IL-17可能通过激活NF-κBp65通路，促进脑出血血肿周围脑组织炎症反应及组织损伤。本实验标本取材于脑出血患者外周血及血肿周围脑组织，真实的反映人脑出血后的病理变化，提示可以通过调控Th17细胞减轻脑出血后血肿周围脑组织炎症反应及组织损伤，为脑出血的治疗开辟新途径。