中国大陆几株WSSV毒株毒力测定及分析

1、中国大陆几株WSSV毒株毒力测定及分析。本研究针对近年来采集获得的7株WSSV毒株分别为020619JN（青岛胶南）、030908JN（青岛胶南）、040831JN（青岛胶南）、060718JN（青岛胶南）、070816DY（东营）、20110908LS(青岛崂山)、20120425001WZ（温州）。经复壮后用健康SPF克氏原螫虾（Procambarusclarkii）作为模式动物测定对虾白斑综合征病毒（WSSV）在克氏原螯虾上的半数致死量（LD50）。经测定其中除20110908LS其余6株WSSV在克氏原螯虾上的半数致死量分别为2.02×106copies/g体重、6.22×103copies/g体重、2.29×103copies/g体重、3.74×103copies/g体重、4.32×103copies/g体重及1.50×105copies/g体重。结果显示六株WSSV毒株的LD50确实存在差异，其中020619JN和20120425001WZ两株半数致死量显著高于其他四个WSSV毒株，且注射感染后，发病死亡速度较为缓慢，发病趋势较缓；除此之外，对各株注射量都为105copies的实验组的肝胰腺WSSV载毒量进行测定，测定结果分别为2.74×107copies/g，5.53×109copies/g，4.20×108copies/g，8.52×108copies/g，3.58×108copies/g，5.26×109copies/g；鳃的WSSV载毒量测定结果分别为1.69×1010copies/g，2.38×1010copies/g，8.17×109copies/g，3.91×109copies/g，3.28×109copies/g，1.05×1010copies/g。实验数据显示020619JN和20120425001WZ两株的肝胰腺和鳃组织载毒量相对其余其他4株要高，表明这两株需要较高的感染量才能致死，毒力显然较弱，属于弱毒株；最后用养殖较为广泛的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）进行半数致死时间验证（LT50），结果六株WSSV毒株的半数致死时间分别为5.4d、3.8d、4.0d、4.8d、3.5d、5.2d。结果显示020619JN和20120425001WZ两株WSSV的半数致死时间长于其余4株。综上所述，各项数据均显示020619JN和20120425001WZ两株WSSV毒力相对其他4株要弱，属于弱毒株，与半数致死量得出的结果一致，说明WSSV的毒力确实存在差异；除此之外，20110908LS在病毒复壮一步时，能够感染克氏原螯虾，但又不能使螯虾发病死亡，表明该株WSSV毒株也可能是一株潜在的弱毒株。2、YHV人工感染克氏原螯虾。本实验利用YHV（Yellow head virus，黄头病毒）阳性患病中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）制备的病毒粗提液感染淡水的SPF克氏原螯虾，并以已知的YHV的宿主凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）作为阳性对照进行人工感染实验。并采集感染实验克氏原螯虾，凡纳滨对虾的组织用组织固定液进行固定，用于制作石蜡切片，进行组织病理学切片观察；另一部分组织用于提取RNA，根据中华人民共和国水产行业标准——对虾黄头病诊断规程第2部分：套式RT-PCR检测法，进行YHV检测。结果显示阳性对照凡纳滨对虾，病理切片观察和YHV套式RT-PCR检测，均证实感染了YHV；但是人工感染的克氏原螯虾却未出现死亡，组织病理学切片也未观察到病变组织，且YHV套式RT-PCR检测显示阴性，本实验结果显示克氏原螯虾不是YHV的宿主，YHV无法感染克氏原螯虾。3、2010年广西北海发病凡纳滨对虾可疑病原的探究。对本实验室2010年9月份采自广西北海的发病对虾样品经几种常见病原的检测，结果均显示阴性。因此怀疑此次病害可能由新病原引起，因而就此推测设计实验方案，通过超速离心纯化可疑的病毒颗粒，用电子显微镜进行观察，发现一些直径30-40nm大小可疑病毒粒子；在分子水平上，利用随机PCR扩增的方法，DNA来源的用V8A2为引物进行随机扩增，RNA来源的核酸用加接头的随机引物FR26RV-N和FR40RV-T尽可能多的捕捉各种不同的和带有A尾的核酸片段，之后进行切胶回收，将回收产物连接T载体后，筛选阳性克隆重组体送去生物公司测序，将测得的核酸序列，到NCBI上进行相近物种比对分析。DNA来源的得到23条序列，RNA来源的核酸得到18条相似度较低的序列。其中有两条序列：一条为49bp的序列与疱疹病毒有一定的相似度；另一条为127bp的序列与钩端螺原体有一定的相似度。4、2012年河北唐海发病对虾携带菌的分离鉴定调查。从2批患病中国对虾肝胰腺和血淋巴中用2216E固体培养基和TCBS选择培养基分离纯化27株共生菌，经过16S rDNA序列测定，比对结果显示这些菌株主要是Vibrio azureus、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、塔氏弧菌（Vibriotubiashii）、弧菌属（Vibrio sp）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、假交替单孢菌属（Pseudoalteromonas sp.）、轮虫弧菌（Vibrio rotiferianus）、美人鱼发光杆菌亚种（Photobacterium damselae subsp）、坎贝尔弧菌（Vibrio campbellii）、发光杆菌属（Photobacterium jeanii）、巴西弧菌（Vibrio brasiliensis）等，所分离的菌株多数为致病菌和条件性致病菌，该项工作对查明近些年来对虾疾病频发提供了一定的参考依据。