硫是生命活动的必需元素,主要以-2和+6价发挥生物学功能。硫的活化是硫同化代谢的关键反应,包括ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase,ATPS)催化硫酸盐与ATP反应生成腺苷-5’-磷酰硫酸(adenosine5’-phosphosulfate,APS)和焦磷酸(pyrophosphate,PPi)以及腺苷-5’-磷酰硫酸激酶(adenosine5’-phosphosulfate kinase,APSK)催化APS的3’羟基磷酸化生成3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸(adenosine3’-phosphate5’-phosphosulfate,PAPS)两步反应。PAPS作为胞内硫酸化反应的硫供体以及PAPS还原酶的底物,可生成3’,5’二磷酸腺苷(3’,5’bisphosphate adenosine,PAP)。酵母3’,5’二核苷酸酶(Yeast3’,5’-Bisphosphate Nucleotidase,YND),亦称为HAL2,催化PAPS或者PAP脱磷酸生成APS或AMP,参与细胞硫代谢和抗盐性。YND和PAP之间具较高的亲和力,其KmPAP为亚微摩尔。此高亲和力及PAP琼脂糖的存在使得YND作为亲和标签纯化蛋白成为可能。亲和层析是最常见的蛋白纯化方法之一,不同的纯化标签都有自己的优缺点,开发新的标签以及组合使用不同标签可不断开发新的亲和层析工艺。为探索YND作为一个蛋白纯化亲和标签的可行性,我们对YND的特性进行了深入分析。结果表明KmPAP和kcatPAP分别为0.3μM和11s-1,在Ca2+或Mg2+存在的情况下其Kd分别为0.008和0.49μM。pH影响YND对PAP的亲和力,pH7.5和pH8时,其亲和力最强Kd为～8nM。通过构建一系列表达YND,YND-APSK,YND-蛋白酶载体,基于Ca2+可有效促进YND·PAP的形成,抑制YND对PAP的水解,且易于被EGTA螯合进行洗脱等,我们合理设计了YND融合蛋白的纯化步骤,并成功纯化、分析大肠杆菌APSK。通过比较不同标签的经济性、促溶、流速、产品纯度和产量等特性,我们发现YND是有效、经济的原核蛋白表达、纯化标签。YND活性的改变可调节胞内PAP的浓度,从而影响磺基转移酶,酰基载体蛋白合酶和RNA加工酶的活性,进而影响细胞的生长发育。PAPS是胞内硫酸转移酶的底物,YND如何区分PAPS和PAP尚无相关报道。通过分析其晶体结构,发现G236的R基团,可能对于PAPS或者PAP的结合具有一定的影响。将G236突变为较大R基团氨基酸,对其相应蛋白进行活性分析发现随着R基团的增大,对PAPS的亲和力降低。G236V水解PAP的催化效率为水解PAPS的5592倍,使得G236V成为PAP特异性3’磷酸核苷酸酶。通过和肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联,G236V可作为偶联酶分析硫酸转移酶的酶学特性。APSK催化APS磷酸化的机理已经较为清楚,但作为APS类似物的AMP是否可以作为APSK的底物,尚无相关报道。通过对APSK的三维结构进行分析发现,R68同时和APS的α磷酸根和p硫酸根形成氢键,稳定APS的结合。而K侧链基团比R短2.4A,R68K突变将导致K不能和距离较远的p硫酸根离子相互作用,从而减弱APS的亲和力,而增加与α磷酸根离子的相互作用,可能提高AMP的亲和力。我们的研究结果表明AMP可作为APSK的底物,反应生成PAP。R68K突变体的最适底物变为AMP,KmAMP降低为对照的0.2倍,而催化效率提高5倍。此结果为进一步构建AMP3’羟基激酶提供了基础。本文构建了一种基于YND的亲和层析体系,一种可用来测定硫酸转移酶活性的PAP特异3’核苷酸酶和可磷酸化AMP形成PAP的3’羟基激酶。
