高效靶向肝癌细胞的嵌合AAV建库及筛选
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腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)属于微小病毒科,病毒基因组DNA为单链线形分子,其两端各有一段结构完全相同的反向末端重复序列(inverted terminal repeats,ITRs)。ITRs之间为两个开放式阅读框架,含有Rep基因与Cap基因。目前鉴定的AAV血清型超过100种,常用的为AAV1-9型。肿瘤治疗的传统方法主要为放疗、化疗、手术切除等,现在又产生了病毒治疗、基因治疗以及联合病毒-基因治疗,目前这些治疗方式都集中了大批科学家在为之努力。传统治疗手法(除了手术切除)都存在靶向性问题,而病毒治疗、基因治疗以及联合病毒-基因治疗目前其靶向性也不能令人满意。Shuffling技术为解决靶向性问题提供了一个坚实的技术基础。它既可以使基因序列发生点突变,也可以使基因片段发生插入、缺失、倒转和整合等,并且可以进行反复改组,使突变效应不断叠加,这是其他的突变技术所无法实现的巨大优势。由于AAV的靶向性是由其Cap基因编码的Cap蛋白所决定的,而通过对Cap基因进行shuffling,可以得到多种多样的各种嵌合型的Cap基因,其编码的蛋白也就会各不相同,从而使其靶向性多样化。因此,从shuffling所得到的AAV Cap基因库中就可能筛选出高效靶向某种特定细胞的Cap基因型。目前在所鉴定出的所有AAV血清型中,以对AAV2研究的最为透彻,其生物学特性也最为清楚,因此用其Rep作为重组AAV载体的通用Rep,其安全性也最高。基于这些原理,本课题所做的的主要研究过程为:(1)通过一系列的载体构建,最终构建出以pAAV-MCS载体为基本骨架载体,含AAV2ITR和Rep2序列的pAdB载体。同时用DNaseI对AAV1-9的Cap基因随机切断,切成大小在100-300bp之间的片段,然后对其进行合拉,使片段随机组合成嵌合的Cap序列。然后再以pAdB载体为基本骨架,将其与合拉的嵌合Cap序列进行连接,构建出pARC载体,重复这一过程,不断构建含有嵌合Cap序列的pARC载体库。(2)用pARC载体包装嵌合AAV病毒并进行筛选:用pARC质粒转染HEK293细胞,并加入5型腺病毒(Ad5),使AAV完成复制表达过程,最终包装出嵌合AAV病毒。接着将包装出的嵌合AAV病毒与Ad5共感染BEL7402肝癌细胞,经过三轮筛选感染后,初步筛选出可以靶向肝癌细胞的嵌合AAV(cAAV)。(3)检测筛选到嵌合AAV病毒的靶向性感染效率。首先将筛选出的AAV Rep2-嵌合Cap基因连接到pMD18-T载体上,构建出pARC-T载体,然后与AAV-EGFP质粒共转染293细胞,并加入Ad5,包装出里面包有EGFP基因、外面包被嵌合Cap外壳的AAV病毒(cAAV-EGFP),最后用cAAV-EGFP感染BEL7402细胞,观察绿荧光的表达。最终观察到绿荧光表达,证明筛选出了对BEL7402肝癌细胞具有一定靶向性的嵌合AAV。测序结果表明,本嵌合AAV的Cap序列是由AAV2,AAV7和AAV8三种AAV的Cap嵌合而成。本研究证明了此方法和技术的可行性,为进一步扩大嵌合AAV库容量和深入的研究做出了有益的探索。
摘要 | 第7-9页 |
Abstract | 第9-10页 |
缩略词表 | 第11-14页 |
第一章 腺相关病毒载体及 Shuffling 研究进展 | 第14-19页 |
1.1 腺相关病毒简介 | 第14-15页 |
1.2 肝癌治疗的研究历史、现状及其基因治疗的发展 | 第15-16页 |
1.3 Shuffling 原理及研究进展 | 第16-18页 |
1.4 本课题的创意及研究内容 | 第18-19页 |
1.4.1 本课题的创意 | 第18页 |
1.4.2 本课题的研究内容 | 第18-19页 |
第二章 pARC 载体库的构建 | 第19-39页 |
2.1 实验器材 | 第19-21页 |
2.1.1 实验材料 | 第19页 |
2.1.2 所需的主要仪器 | 第19-20页 |
2.1.3 主要试剂 | 第20页 |
2.1.4 主要试剂的配制 | 第20-21页 |
2.1.5 所用引物 | 第21页 |
2.2 方法 | 第21-35页 |
2.2.1 pAdB 载体的构建 | 第21-30页 |
2.2.2 AAV1-9 Cap 片段的获得 | 第30-31页 |
2.2.3 AAV1-9 Cap Shuffling | 第31-32页 |
2.2.4 pARC 载体库的构建 | 第32-35页 |
2.3 结果 | 第35-39页 |
2.3.1 AAV1-9 Cap 片段 PCR 结果电泳 | 第35页 |
2.3.2 AAV1-9 Cap 片段 DNaseI 酶切及 Shuffling 结果电泳 | 第35-36页 |
2.3.3 pAdB 载体构建相关电泳图 | 第36-38页 |
2.3.4 pARC 载体的鉴定 | 第38-39页 |
2.4 讨论 | 第39页 |
第三章 细胞培养及嵌合 AAV 的筛选 | 第39-47页 |
3.1 实验器材 | 第39-41页 |
3.1.1 实验所需材料及试剂 | 第39-40页 |
3.1.2 实验所需仪器 | 第40页 |
3.1.3 主要试剂的配制 | 第40-41页 |
3.2 实验方法 | 第41-44页 |
3.2.1 细胞培养 | 第41-42页 |
3.2.2 pARC 质粒转染 HEK293 细胞 | 第42-43页 |
3.2.3 嵌合 AAV 的筛选 | 第43页 |
3.2.4 PCR 检测筛选到的嵌合 AAV(cAAV) | 第43-44页 |
3.3 实验结果 | 第44-46页 |
3.3.1 pARC 质粒转染 HEK293 细胞相关实验荧光图 | 第44-46页 |
3.3.2 cAAV PCR 检测电泳图 | 第46页 |
3.4 讨论 | 第46-47页 |
第四章 cAAV 感染活性的检测 | 第47-56页 |
4.1 实验器材 | 第47-50页 |
4.1.1 实验所需材料 | 第47页 |
4.1.2 实验所需仪器 | 第47-48页 |
4.1.3 实验所需主要试剂 | 第48-49页 |
4.1.4 主要试剂的配制 | 第49-50页 |
4.2 实验方法 | 第50-53页 |
4.2.1 pARC-T 载体的构建 | 第50-52页 |
4.2.2 pARC-T 质粒与 pAAV-EGFP 共转染 HEK293 细胞包装 cAAV-EGFP | 第52-53页 |
4.2.3 cAAV-EGFP 感染活性的检测 | 第53页 |
4.3 实验结果 | 第53-55页 |
4.3.1 pARC-T 载体的鉴定 | 第53-54页 |
4.3.2 cAAV-EGFP 感染 BEL7402 细胞荧光图及 cCap 序列结构模式图 | 第54-55页 |
4.4 讨论 | 第55-56页 |
总结 | 第56-57页 |
参考文献 | 第57-60页 |
附录 | 第60-63页 |
致谢 | 第63页 |
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