他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,为降脂药物中的首选药物,也是国内外研究的热点之一。无锡他汀(本实验室拥有自主知识产权)是一种新型HMG-CoA还原酶抑制剂,由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)转化产生。本论文主要对Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀的发酵条件进行了研究,并对转化产物无锡他汀分离提取进行初步探索。首先,在摇瓶水平上研究发酵条件对Amycolatopsis sp.ST2710菌体形态、洛伐他汀转化率的影响。通过对培养基初始pH值、装液量、接种方式、接种量和摇床转速等因素对菌体形态影响的考察。结果表明,当菌丝球大小较均匀,菌球为直径0.5~0.7 mm时有利于洛伐他汀的转化。故剪切力的大小是影响洛伐他汀的转化效率的关键因素。同时,考察了洛伐他汀溶液对Amycolatopsis sp.ST2710生长的影响,洛伐他汀临界抑制浓度为1.5 g/L,洛伐他汀添加浓度以1.0 g/L为宜;洛伐他汀转化的适宜温度为28℃,与菌体生长期的最适温度一致;经发酵条件优化后,最佳发酵条件为:培养基初始pH 7.0~8.0、装液量25 mL/250 mL三角瓶、接种方式为孢子接种、接种量10%、摇床转速为120 r/min,无锡他汀的产量可达0.48 g/L。根据摇瓶水平分批发酵最优条件,对菌株Amycolatopsis sp.ST2710进行5 L发酵罐分批发酵试验。分别考察搅拌转速对溶氧、菌体量、菌体形态和洛伐他汀转化的影响。结果表明,转速为300 r/min时能提供充足的氧气使细胞快速生长;而较低的转速(200 r/min)能在转化阶段减少泡沫的产生,有利于洛伐他汀的转化。基于不同搅拌转速下的洛伐他汀转化率的变化情况,提出了分阶段搅拌转速控制策略:第一阶段,菌体生长期搅拌转速300 r/min;第二阶段,洛伐他汀转化期搅拌转速200 r/min。经实验验证,采用搅拌转速控制策略,菌体生长末期,菌体量达4.02 g/L,至转化结束时,无锡他汀产量达0.50 g/L,发酵周期为80 h,比摇瓶发酵缩短了16 h。为有效减缓底物洛伐他汀的抑制,进行了5 L罐补料分批发酵研究。对洛伐他汀采用补料分批发酵,产物产量达1.21 g/L,与未补料发酵相比产量提高1.4倍。此外,从5种树脂中筛选出HP20树脂,对发酵液中无锡他汀进行分离提取,考察了HP20树脂的吸附、解吸效果及影响因素。静态实验表明,非极性树脂HP20对无锡他汀的吸附容量为89.89 mg(无锡他汀)/g(干树脂),最佳吸附pH为7.0左右,适宜吸附时间为3 h左右,洗脱剂为丙酮水溶液,洗脱率达95.3%。动态实验确定吸附流速为1.0 BV/h时,每毫升湿树脂对发酵液中无锡他汀的吸附量为60 mg,较佳的上样浓度为0.9~1.1 g/L,用丙酮水溶液进行分阶段梯度洗脱,含无锡他汀的洗脱液为无色,无锡他汀回收率和浓度分别达75%和95%。
