目的：本研究旨在探索与人类DM相关的突变型(前)胰岛素原在胰岛β细胞功能衰竭中的作用。通过检测5个具有不同生物学特性的突变型(前)胰岛素原C(A7)Y、G(B8)S、G(C28)R、R(SP6)H和V(A3)L,对共存的人野生型胰岛素原的显性负效应以及二硫键在显性负效应中的作用,比较不同突变型胰岛素原对内质网应激(ESR)和非折叠蛋白反应(UPR)信号通路的影响,探讨了突变型(前)胰岛素原导致β细胞衰竭的两种相互关联的分子机制,以期为今后最终阐明糖尿病的发病机理并从根本上治疗糖尿病提供有价值的理论和实验依据。方法：1.研究突变型胰岛素原对共存的野生型胰岛素原的显性负效应以及二硫键在显性负效应中的作用(1)将5个含不同突变型小鼠前肤岛素原cDNA的重组质粒：C(A7)Y,G(B8)S,G(C28)R,R(SP6)H和V(A3)L,分别与含野生型人前胰岛素原cDNA的重组质粒共转染入293T细胞中,设为HWT+C(A7)Y组、HWT+G(B8)S组、HWT+G(C28)R组、HWT+R(SP6)H组和HWT+V(A3)L组。共转染含人野生型和小鼠野生型前胰岛素原cDNA的重组质粒,设为正常对照组(HWT+MWT组)。转染48小时后,应用特异性人胰岛素原放免试剂盒测定细胞培养液和细胞裂解液中人胰岛素原水平。(2)用含突变型前胰岛素原-DelCys(胰岛素原分子中所有六个半胱氨酸残基均被突变,不能形成二硫键)cDNA的重组质粒和含野生型人前胰岛素原cDNA的重组质粒共转染293T细胞(HWT+DelCys组),共转染含人野生型和小鼠野生型前胰岛素原cDNA的重组质粒,设为正常照组(HWT+MWT组)。用放射免疫分析法测定转染细胞裂解液和培养液中人胰岛素原水平。2.研究突变型胰岛素原对ERS和UPR信号通路的影响用含小鼠野生型和不同突变型前胰岛素原cDNA:C(A7)Y、G(B8)S、G(C28)R,R(SP6)H、V(A3)L、DelCys的重组质粒分别转染293T细胞,设为MWT组、C(A7)Y组、G(B8)S组、G(C28)R组、R(SP6)H组、V(A3)L组和DelCys组。转染72小时后将细胞分为两组,一组细胞提取总RNA,采用RT-PCR法检测细胞内剪切型和非剪切型X-盒结合蛋白(XBP-1)mRNA的表达水平。另一组细胞用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞提取蛋白,采用Western Blot检测细胞中免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、真核细胞转录起始因子α(eIF2α)和磷酸化eIF2α的蛋白表达水平。结果：1.研究突变型胰岛素原对共存的野生型胰岛素原的显性负效应以及二硫键在显性负效应中的作用(1)细胞裂解液中,各组人胰岛素原水平与HWT+MWT组相比无统计学差异(P>0.05)。细胞培养液中,与HWT+MWT组(135.84±1.89pM)相比,HWT+C(A7)Y组(29.28±6.85pM)和HWT+G(B8)S组(33.62±10.52pM)人胰岛素原水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。HWT+G(C28)R组(133.31±2.59pM)、HWT+R(SP6)H组(135.84±2.11pM)和HWT+V(A3)L组(132.80±5.39pM)人胰岛素原水平均未减少,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)HWT+DelCys组细胞裂解液和培养液中人胰岛素原水平较HWT+MWT组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。2.研究突变型胰岛素原对ERS和UPR信号通路的影响(1)与MWT组相比,C(A7)Y组、G(B8)S组、DelCys组细胞内剪切型/未剪切型XBP-1mRNA水平升高,XBP-1mRNA的剪切显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。V(A3)L组、R(SP6)H组和G(C28)R组细胞内XBP-1mRNA的剪切较MWT组相比未见增多,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)与MWT组相比,C(A7)Y组、G(B8)S组、DelCys组细胞中BiP蛋白表达明显增强、eIF2α蛋白磷酸化水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。V(A3)L组、R(SP6)H组和G(C28)R组细胞内BiP表达和eIF2 a蛋白磷酸化水平,与MWT组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.与青少年糖尿病相关的突变型胰岛素原C(A7)Y和G(B8)S显著降低了共表达的野生型胰岛素原的分泌,对共存的野生型胰岛素原具有显性负效应。突变型胰岛素原在细胞内的表达还可引起细胞ERS和UPR,激活IRE1-XBP1和PERK-eIF2α-ATF4信号传导通路。这两个突变可能是通过显性负效应和ESR两种途径导致胰岛β细胞衰竭的。2.与青少年糖尿病相关的突变型胰岛素原R(SP6)H、G(C28)R和可致成年发病的突变型胰岛素原V(A3)L对共表达的野生型胰岛素原不产生显性负效应,而且突变在细胞内的表达未引起ERS和UPR,表明不同的突变型胰岛素原可能通过不同的机制导致人类DM。3.突变型胰岛素原-Delcys尽管造成严重的错误折叠,引起细胞ERS和UPR信号传导通路的激活,但并不影响共表达的野生型胰岛素原的分泌,对共存的野生型胰岛素原未产生显性负效应,这初步表明异常的二硫键在突变型胰岛素原的显性负效应中起着非常重要的作用,突变型对野生型的显性负作用是通过分子间的二硫键达到的。
