[背景1由于冠心病(CAD)药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗(PCI)和冠状动脉旁路移植治疗(CABG)疗效有限、费用昂贵、技术复杂及并发症凶险,迄今尚无任何方法可以根治或基本解决CAD,人类迫切需要寻找高效、安全、简便、经济的冠心病新疗法。研究者纷纷开展了基因疗法和细胞移植,但是在操作中需要使用导管或开胸将基因或细胞植入心脏,具有不可重复性。体外心脏震波治疗系统(Extracorporeal Cardiac Shock Wave Therapy, CSWT)正是在此背景下产生,并已通过体外实验和动物模型证实,低能量的冲击波能促进受损的组织产生一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)使其受体表达上调,从而促进缺血组织新生毛细血管的生成和加速侧支循环的建立,改善心肌缺血,提高心脏射血分数,减少左心室的重构,降低病死率。但体外心脏震波治疗改善缺血心肌微环境、促进缺血心肌组织内血管生成的作用机制尚不清楚。因此,深入研究体外心脏震波促血管新生的分子机制,寻找其作用靶点具有重要意义。第一部分：体外心脏震波治疗冠心病的临床疗效与安全性[目的1探讨CSWT治疗冠心病的有效性、安全性及显效机理,总结CSWT的方法学和技术细节,找寻CSWT治疗的适宜人群。[方法]2008年8月-2010年12月入住昆明医学院第一附属医院心内科的陈旧性心肌梗死、稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛患者26例,病史1-16年。所有患者经冠状动脉造影或多层螺旋CT冠脉成像发现冠脉中、重度狭窄,无论是否行PCI或CABG均给予正规药物治疗,仍有缺血症状,运动耐量改善不明显,1年内因上述原因住院2次以上。排除标准为急性心肌梗死1月内、左室射血分数低于30%者、严重慢性阻塞性肺病。使用多巴酚丁胺负荷超声心动图(DSE)和基础及负荷状态下99mTc-MIBI心肌灌注显像(MPI)识别并定位缺血/存活心肌;使用瑞士STORZ MEDICAL公司生产的震波治疗仪行体外心脏震波治疗,治疗时经机载实时超声探头锁定缺血靶区,每个靶区实施-1-0-+1两两组合的9点治疗,每点发放200次脉冲,每次脉冲能量为0.09mJ/mm2。整个过程实时心电、血压、血氧饱合度监测。所有患者均于治疗前后行6分钟步行距离(6MWT)、NYHA心功能分级、CCS心绞痛分级、SAQ评分、硝酸甘油用量、事件追踪等评价疗效；采用静息及负荷状态下收缩期峰值应变率(PSSR)和MPI评价局部心肌收缩功能和血流灌注,测量左室舒张末内径(LVDd)和左室射血分数(LVEF)等评价CSWT的疗效及安全性。在震波前、第3次及第9次震波后分别行心肌酶学检测。[结果]26例患者均顺利完成CSWT疗程,无呼吸困难、心力衰竭、晕厥、栓塞、心悸、出血或休克等并发症。DSE和负荷MPI共同检出存活／缺血心肌节段40个。26例患者治疗后6MWT、NYHA心功能分级、SAQ和CCS心绞痛分级明显改善[6MWT:(360.69±116.79)m比(434.15±86.29)m, NYHA:(1.85±0.21)比(1.23±0.08),SAQ(67.58+13.03)比(77.54±10.84),均P<0.01,CCS：(1.85+0.15)比(1-9±0.08),P<0.001],硝酸甘油用量明显减少[(1.00±0.27)比(0.50±0.19),P<0.01]；基础和负荷状态下MPI明显增加[基础：(1.04±0.19)比(2.16±0.16),P<0.001；负荷：(0.80±0.16)比(1.40±0.16),P<0.01]；PSSR基础状态下无明显改变[(1.04±0.43)比(1.21±0.62),P>0.05],负荷状态下明显增强[(1.35±0.66)比(2.02±1.00),P<0.001]。LVDd和LVEF无明显改变[LVDd:(53.81±7.34)mm比(53.27±6.68)mm; LVEF(53.69±12.70)%比(55.27±10.87)%,均P>0.05]；心肌酶学治疗前后无明显改变(P>0.05)。[结论]①CSWT治疗复杂CAD无创、安全、有效,治疗早期就显示缓解心绞痛症状、增加冠脉储备、多项心肌灌注指标改善、生活质量提高。②CSWT可能是通过促缺血区心肌血管新生达到发挥治疗CAD作用。③CSWT治疗的适应人群似可扩展到非终末期CAD患者。④DSE联合负荷MPI可更准确检出微血管性缺血心肌,可提高CSWT靶心肌定位的精确性和有效性。⑤CSWT治疗的范围、能量应根据患者具体情况个体化实施。第二部分：体外心脏震波诱导EPCs增殖促缺血心肌血管新生的研究[目的]探讨经CSWT治疗后CAD患者外周血EPCs增殖情况和相关细胞因子变化。[方法] 26例CAD患者与第一部分相同,所有患者均在治疗前后采集外周血单个核细胞,分别行EGM-2-MV培养基培养,观察EPCs形态和集落形成数量,激光共聚焦显微镜鉴定EPCS;流式细胞术(Flow Cytometry)直接检测外周血EPCs数量；ELISA法检测治疗前后外周血细胞因子VEGF、IL-8、SDF-1和MMP-9的水平。[结果]体外培养的EPCs数量、细胞集落形成数较治疗前明显增多[(18.85±4.30)和(5.08±1.79)个／高倍视野比(30.12±6.77)和(12.27±2.75)个／高倍视野,均P<0.001]；外周血EPCs数量较治疗前明显增多[(0.015±0.003)%比(0.021±0.005)%,P<0.001]；外周血细胞因子VEGF、IL-8较治疗前明显增加[VEGF:(120.26±19.85)pg/ml比(155.19±24.67)pg/ml, IL-8:(21.81±5.94) pg/ml比(149.70±44.11)pg/ml,均P<0.01]；SDF-1、MMP-9较治疗前无明显变化[SDF-1：(2750.87±636.74)pg/m比(2700.47±415.19)pg/ml, MMP-9:(19.66±3.96) ng/ml比(18.55±3.78)ng/ml,均P>0.05]。[结论]①CSWT治疗似可促进VEGF、IL-8蛋白质的表达。②CSWT治疗似可促进EPCs的增殖。③CSWT治疗似可显著提高外周血EPCs的数量及功能。④CSWT治疗对SDF-1、MMP-9表达的影响似不明显。第三部分：超声震波对HUVECs增殖及最佳能量探讨[目的1探讨不同强度超声震波能量对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、分化及相关细胞因子的影响,探寻超声震波的最佳能量。[方法]对体外培养的HUVECs细胞株施予不同级别能量(0,0.03,0.09,0.18,0.24mJ/mm2)的震波处理,CCK8比色法检测细胞增殖情况,Real-time PCR法、Western-blot法及Flow Cytometry法检测CSWT处理后细胞因子VEGF、IL-8、ICAM-1mRNA水平和蛋白质的水平变化。[结果]0.09mJ/mm2的震波能量显著促进HUVECs增殖(P<0.05)；Real-timePCR结果显示在使用0.09 mJ/mm2能量时HUVECsVEGF、IL-8和ICAM/1mRNA的表达较对照组明显增加(P<0.001)；使用0.03mJ/mm2能量显著增加ICAM-1mRNA的表达(P<0.01),但没有增加VEGF、IL-8mRNA表达(P>0.05)；0.18mJ/mm2能量时显著增加VEGFmRNA的表达(P<0.01),IL-8、ICAM/1mRNA的表达较对照组无明显增加(P>0.05),0.24mJ/mm2能量时VEGF、IL-8、ICAM-1mRNA的表达较对照组无明显改变(P>0.05);Western-blot结果显示在使用0.09 mJ/mm2能量处理HUVECs时VEGF、ICAM-1蛋白表达较对照组明显增加(P<0.05)；使用0.03、0.18、0.24mJ/mm2能量增加VEGF蛋白的表达(P<0.05),ICAM-1蛋白表达较对照组无明显改变(P>0.05);Flow Cytometry结果显示使用0.09：mJ/mm2能量时VEGF、IL-8表达明显较对照组增加(P<0.05)；0.03、0.18、0.24mJ/mm2能量显著增加VEGF的表达(P<0.05),IL-8的表达较对照组无明显改变(P>0.05)。[结论]①体外不同震波能量处理HUVECs均有不同程度促增殖作用,0.09mJ/mm2的能量促细胞增殖作用显著。②0.09mJ/mm2的能量促进IL-8、ICAM-1 mRNA及其蛋白质水平表达最显著。③0.09mJ/mm2的能量促进VEGFmRNA及其蛋白质的表达最显著。④0.03-0.24mJ/mm2不同的能量对细胞因子VEGF、IL-8和ICAM-1的分泌也有一定的促进作用。本研究采用CSWT治疗CAD患者和处理体外培养的HUVECs,发现CSWT安全、简便,使CAD患者临床疗效和提示心肌灌注的客观指标改善,CSWT的显效机理可能是合适能量的震波促进多种细胞因子分泌、表达,促进EPCs和HUVECs增殖,进而促进心肌缺血区血管新生。
