HMGB1-Abox对SW480和THP-1细胞LPS/TLR4信号通路的影响

目的：观察HMGB1-Abox高表达对肠上皮细胞株SW480和单核细胞株THP-1中LPS/TLR4的影响，为以HMGB1-Abox为靶点治疗IBD提供理论和实验依据。方法：㈠LPS对SW480细胞HMGB1表达的影响实验分组如下：①对照组：SW480+0ng/ml LPS；②实验组1：SW480+100ng/ml LPS；③实验组2：SW480+1000ng/ml LPS；④实验组3：SW480+10000ng/ml LPS；培养SW480细胞至对数生长期，给予不同浓度LPS分别作用12h、24h收集细胞检测HMGB1的表达（重复3次）。㈡构建和鉴定HMGB1-Abox高表达细胞株⑴HMGB1-Abox重组真核质粒的构建及鉴定①在GeneBank中查找人HMGB1-A box基因序列，由公司基因合成。②将合成的HMGB1-A box基因插入到pEGFP-N1载体，构建重组质粒。扩增及提取重组质粒，鉴定方法采用酶切和测序。⑵HMGB1-Abox重组真核质粒在SW480细胞内的表达采用阳脂质体转染技术将pEGFP-N1-HMGB1-A box转染SW480细胞，分别观察有无绿色荧光及荧光强度，并收集细胞检测HMGB1-Abox mRNA表达水平（重复3次）。㈢HMGB1-A box高表达和EP对SW480肠上皮细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子的影响实验分组：①对照组：SW480细胞；②EP组：SW480细胞+EP；③空质粒组：转染空质粒的SW480细胞；④Abox质粒组：转染HMGB1-Abox质粒的SW480细胞上述各组再分为LPS及无LPS处理。（EP为5mM，预处理1h，LPS为1000ng/ml，24h），24h后收集细胞培养上清及细胞（重复3次）。㈣EP及HMGB1-A box高表达SW480细胞与THP-1细胞共培养对THP-1细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子分泌的影响用Transwell系统将SW480细胞和THP-1细胞共培养，实验分组：①对照组：SW480细胞+THP-1；②EP组：SW480细胞+EP+THP-1；③空质粒组：转染空质粒的SW480细胞+THP-1；④Abox质粒组：转染HMGB1-Abox质粒的SW480细胞+THP-1上述各组再分为LPS处理及无LPS处理。（EP为5mM，预处理1h，LPS为1000ng/ml，24h），24h后收集细胞培养上清及细胞（重复3次）。㈤检测方法：①实时荧光定量PCR方法检测细胞HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表达。②免疫印迹方法检测细胞HMGB1、TLR4、MyD88、pNF-κB p65蛋白表达。③双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中HMGB1含量。④固相多重双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。结果：㈠LPS对SW480细胞内HMGB1的影响：①不同浓度的LPS处理SW480细胞12h，SW480细胞HMGB1mRNA表达都有升高，其中LPS浓度为100ng/ml组与对照组相比，有统计学差异（P<0.05）；不同浓度LPS处理24h时，SW480细胞HMGB1mRNA表达都有升高，其中1000ng/ml组HMGB1mRNA表达与对照组相比，有统计学差异（P<0.01），而其它组间HMGB1mRNA表达无统计学差异（P>0.05）。②LPS处理SW480细胞不同时间，24h组HMGB1mRNA表达均高于12h组，但只有1000ng/ml组有统计学意义（P<0.05），故本实验选用LPS的处理时间为24h，作用浓度为1000ng/ml。㈡构建和鉴定HMGB1-Abox高表达SW480细胞⑴HMGB1-Abox重组真核表达质粒的构建及鉴定成功构建pEGFP-N1-HMGB1-A box重组表达质粒，酶切后琼脂糖凝胶电泳显示两条带，其分子量大小与预期大小相同。测序分析显示插入片段与PubMed基因文库（GenBank Accession: NM002128.4）中的HMGB1-A box基因序列相似性为100%。⑵HMGB1-Abox重组真核质粒在SW480细胞内的表达HMGB1-A box重组质粒转染SW480细胞后，在荧光显微镜下出现绿色荧光。细胞内HMGB1-Abox mRNA表达高于未转染组（P<0.01），提示转染成功。㈢EP和HMGB1-A box高表达对SW480细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子分泌的影响⑴各组细胞内HMGB1mRNA及蛋白表达：HMGB1mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）,在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A box转染组（P<0.05），后3组之间无统计差异（P>0.05）；除EP组，各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05,0.01）。⑵各组细胞内TLR4mRNA及蛋白的表达：TLR4mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）,在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A box转染组（P<0.05），后3组之间无统计差异（P>0.05）；除EP组，各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05,0.01）。⑶各组细胞内MyD88蛋白的表达：MyD88mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）,在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A box转染组（P<0.05），后3组之间无统计差异（P>0.05）；除EP组，各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05,0.01）。⑷各组细胞内pNF-κB p65蛋白的表达：pNF-κBp65蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）,在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组（P<0.05），后3组之间无统计差异（P>0.05）；除EP组，各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05,0.01）。⑸各组细胞培养上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量：①HMGB1的含量在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）,在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组（P<0.05），后3组之间无统计差异（P>0.05）；除EP组，各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.01）。②IL-1β、TNF-α和IL-6的含量在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）,在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组（P<0.05，0.01），后3组之间无统计差异（P>0.05）；除EP组，各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05，0.01）。㈣EP及HMGB1-A box高表达SW480细胞与THP-1细胞共培养对THP-1细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子分泌的影响⑴各组细胞内HMGB1mRNA及蛋白表达：THP-1细胞与SW480细胞共培养后，THP-1细胞中HMGB1mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）；在LPS处理组HMGB1mRNA表达在EP组显著低于对照组和空质粒组（P<0.05），Abox转染组显著低于空质粒组（P<0.05），HMGB1蛋白表达在EP组和A box转染组显著低于对照组和空质粒组（P<0.05）；除EP组和Abox转染组，各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05,0.01）。⑵各组细胞内TLR4mRNA及蛋白的表达：THP-1细胞与SW480细胞共培养后，THP-1细胞中TLR4mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）；在LPS处理组TLR4mRNA表达在EP组和A box转染组显著低于对照组和和空质粒组（P<0.05），TLR4蛋白表达在EP组显著低于对照组和空质粒组（P<0.01），A box转染组显著低于空质粒组（P<0.05）；除EP组和Abox转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05,0.01）⑶各组细胞内MyD88mRNA及蛋白的表达：THP-1细胞与SW480细胞共培养后，THP-1细胞中MyD88mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）；在LPS处理组MyD88mRNA和蛋白表达在EP组和A box转染组显著低于对照组和空质粒组（P<0.05）；除EP组和A box转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05,0.01）。⑷各组细胞内pNF-κB p65蛋白的表达：THP-1细胞与SW480细胞共培养后，THP-1细胞中pNF-κBp65蛋白表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）；在LPS处理组pNF-κBp65蛋白表达在EP组和A box转染组显著低于对照组（P<0.01）；A box转染组显著低于空质粒组（P<0.01），除EP组和Abox转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.05）。⑸各组细胞培养上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量：①THP-1细胞与SW480细胞共培养后，培养上清中HMGB1含量在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）；在LPS处理组HMGB1含量在EP组和Abox转染组显著低于对照组和空质粒组（P<<0.05，0.01）；除EP组和Abox转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P<0.01）。②THP-1细胞与SW480细胞共培养后，培养上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量在无LPS处理组之间无统计学差异（P>0.05）；在LPS处理组它们的含量在EP组和A box转染组显著低于对照组和和空质粒组（P<0.01）；除EP组和A box转染组各LPS处理均显著高于相对应的无LPS处理组（P>0.05，P<0.01）。结论：1、LPS可激活SW480和THP-1细胞TLR4信号通路及上调HMGB1的表达，促进促炎细胞因子分泌。2、HMGB1-Abox高表达SW480与THP-1细胞共培养可抑制后者表达和分泌HMGB1及并抑制LPS/TLR4信号通路和促炎细胞因子分泌。3、EP可以抑制SW480和THP-1细胞HMGB1的表达和分泌，并抑制LPS/TLR4信号通路及促炎细胞因子分泌。