肺炎链球菌是引起人类疾病的重要病原菌之一,可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病,导致全球每年约160万人死亡。肺炎链球菌主要的致病因子包括肺炎链球菌磷壁酸、溶血素及细胞壁荚膜。胆碱是肺炎链球菌细胞壁和夹膜的重要组分,同时也是其生长必须的营养成分。胆碱对肺炎链球菌的分裂、转化、自溶以及胆碱结合蛋白的形成具有至关重要的作用。肺炎链球菌的胆碱合成代谢途径主要由lic基因簇编码的8个蛋白质构成。肺炎链球菌胆碱合成代谢通路的研究有助于我们更好地理解其致病机制,同时对于新型抗菌药物的研制具有重要的指导意义。LicA是肺炎链球菌胆碱激酶,催化ATP和胆碱反应生成ADP和磷酸胆碱。我们通过X射线晶体学的方法解析了LicA的apo-form以及LicA与choline、AMP和ADP复合物晶体结构,衍射分辨率分别为1.94A,2.01A,1.45A和1.86A。LicA的底物结合位点分析以及底物结合相关氨基酸的突变酶活实验揭示了对于催化可能起关键作用的残基。通过复合物结构与apo-form的结构比对我们发现LicA在底物结合以及产物生成时都伴随着诱导契合的构象变化。同源结构比对和序列分析显示LicA与真核胆碱激酶相比在胆碱结合口袋附近的loop α7-α8缺失,这导致LicA酶催化速率降低。另一方面,我们发现抑制剂HC-3在体外对于LicA的酶活有一定的抑制效果,同时在体内也能影响肺炎链球菌的生长和分裂。这些结果为新型抗菌药物的研究提供了一定的理论依据。LicD2是肺炎链球菌的磷酸胆碱转移酶,以CDP-choline作为底物供体,以磷壁酸上的GalNAc作为底物受体,将磷酸胆碱转移到磷壁酸形成磷脂酰胆碱。LicD2作为一个膜结合蛋白,在大肠杆菌重组表达过程中定位在细胞膜上,因此重组LicD2采用膜蛋白方法进行纯化。纯化过程中对于去垢剂的摸索发现利用磷脂酰胆碱类似物型去垢剂Fc-12纯化获得的蛋白状态最优。我们通过荧光光谱实验分别测定了LicD2与CDP-choline和GalNAc的结合解离常数约为145μM和34μM同时,对LicD2及其底物复合物晶体进行了初步研究,并获得了一些晶体生长条件,为后续的LicD2结构与催化机制研究提供一定的理论依据。肺炎链球菌胆碱激酶LicA和磷酸胆碱转移酶LicD2的结构和功能研究有助于我们更好地理解其致病机制,同时对于新型抗菌药物的研制具有重要的指导意义。
