肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理学基础,是形成肝硬化的必经病理阶段,也是临床治疗慢性肝病的关键环节。其组织学特征表现为以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分合成增多、降解相对不足而在肝内过量沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是产生ECM的主要来源,HSC的增殖活化是肝纤维化发生的中心事件。通过抑制HSC增殖、诱导HSC凋亡来阻断甚至逆转肝纤维化的发展,是抗肝纤维化治疗的重要策略。血红素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)是人类和哺乳动物组织中广泛存在的一种加氧酶,是催化血红素的起始酶和限速酶。HO-1及其催化产物一氧化碳(Carbon Monoxide, CO)、胆红素及转铁蛋白在体内有显著的抗炎、抗氧化、调控细胞凋亡等重要作用。有研究显示,HO-1在肝移植、急性肝损伤和缺血再灌注损伤等多种肝脏损害中,对肝细胞均具有保护作用。在慢性肝病进展过程中诱导HO-1表达,可以减少Ⅰ型胶原的分泌,有效阻止肝纤维化的进展。过氧化物酶体增生因子激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)是一种配体激活的转录因子,其亚型PPARγ主要分布于HSC。在肝纤维化进展过程中,上调PPARγ表达可以抑制HSC激活、诱导HSC凋亡,进而减轻肝纤维化的程度。核转录因子-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)是具有转录激活功能的蛋白质,活化的NF-κB可促进HSCs增殖及胶原的产生、诱导TNF-a、IL-6及TGF-β等相关细胞因子与纤维化因子的释放、并减少HSCs凋亡,在促进在肝纤维化进程中同样发挥重要作用。研究发现,PPARγ可以直接与NF-κB的亚基p50/p65结合,或通过竞争结合协同活化因子p300和CBP来抑制NF-κB DNA合成、转录与表达,诱导HSC的凋亡。对肝纤维化发生、发展起重要的负调控作用。已有其他领域的研究显示,HO-1同PPARγ之间存在相互调控,HO-1启动子区的基因多态性影响PPARγ的转录活性；HO-1的启动子区域还有NF-κB结合位点,诱导HO-1表达可以抑制NF-κB、TNF-α及IL-6等相关细胞因子的分泌。有关HO-1对肝脏保护机制的研究目前主要集中于HO-1的分解产物如胆绿素、一氧化碳(CO)和自由铁的抗氧化及抗炎作用等方面,而HO-1对肝纤维化相关信号分子调控方面的研究尚未见报道。为此,本课题从在体动物实验和体外细胞实验两方面入手,观察HO-1的表达对大鼠肝纤维化及HSC-T6增殖、活化与凋亡的影响,同时研究HO-1表达对HSC-T6中PPARγ、NF-κB及其下游炎性信号分子与凋亡相关因子表达的影响,以进一步探讨HO-1调控HSC-T6增殖、活化及凋亡,进而阻止肝纤维化进展的信号分子机制。本课题包括以下三部分：第一部分血红素加氧酶-1对大鼠肝纤维化及相关信号分子表达的影响第二部分血红素加氧酶-1对大鼠肝星状细胞增殖、活化及凋亡的影响第三部分血红素加氧酶-1对大鼠肝星状细胞调控作用的信号分子机制第一部分血红素加氧酶-1对大鼠肝纤维化及相关信号分子表达的影响目的：研究在构建实验性肝纤维化大鼠模型的过程中抑制/诱导HO-1的表达对大鼠肝纤维化进程及相关信号分子表达的影响。方法：采用复合因素构建肝纤维化大鼠模型。实验分组：正常对照组,4周模型组,6周模型组,ZnPP-Ⅸ干预组,Hemin干预组。在造模第4～6周分别给予HO-1的诱导剂Hemin及抑制剂Znpp-Ⅸ隔口腹腔注射进行干预。HE、Masson染色观察肝脏病理组织学变化；免疫组织化学染色观察肝组织中HO-1及α-SMA的分布与表达；全自动生化分析仪检测血清各项生化指标；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中透明质酸(HA)及Ⅲ型前胶原(PⅢP)水平；分光光度法检测组织中羟脯氨酸(Hyp)含量;采用Real-time PCR技术检测肝组织中α-SMA、HO-1、PPARγ及NF-κB的mRNA表达;采用Western blot技术检测肝组织中HO-1、PPARγ及NF-κBp65的蛋白表达。结果：1、HE及Masson染色结果表明肝纤维化模型构建成功。Hemin干预组胶原纤维的增生、肝小叶的破坏及假小叶的形成程度明显低于同期模型组及Znpp-Ⅸ干预组(P<0.05)：2、免疫组织化学染色及Real-time PCR、Western blot检测各实验组大鼠肝脏HO-1表达的结果显示：随着造模时间延长,纤维化肝组织中HO-1表达范围扩大且.强度增加(P<0.01)：Hemin干预组HO-1表达范围及强度较对照组及模型组增加更加明显(P<0.01),而Znpp-Ⅸ干预组HO-1表达强度则减弱(P<0.01);3、免疫组织化学染色及Real-time PCR检测大鼠肝脏α-SMA表达的结果显示：肝纤维化进展过程中肝组织中α-SMA表达逐渐增加,Hemin的干预使α-SMA的表达明显下降(P<0.01),Znpp-Ⅸ干预组α-SMA的表达则增加(P<0.05)；4、各实验组大鼠肝脏生化指标的变化：大鼠肝功能的损害程度随肝纤维化的进展而逐渐加重(P<0.05)；Hemin干预组ALT、AST、ALB及TBIL各项生化指标较同期模型组及Znpp-Ⅸ干预组则明显恢复(P<0.05);5、各实验组大鼠肝脏胶原代谢的变化：大鼠血清HA、PⅢP及肝组织中Hyp含量随着肝纤维化程度的加重而逐渐增加(P<0.05),Hemin的干预使HA、PⅢP及Hyp含量较同期模型组.及Znpp-Ⅸ干预组明显下降(P<0.05)；6、Real-time PCR及Western blot检测各实验组大鼠肝组织中PPARy mRNA及蛋白表达显示：随着肝纤维化程度的加重,肝组织内PPARy的mRNA表达逐渐下降(P<0.01),使用Znpp-IX的干预组同6周模型组相比虽无统计学意义,但仍有下降趋势(P=0.195)；而Hemin干预组PPARy的mRNA表达则较6周模型组明显增加(P<0.05)。PPARy蛋白表达与mRNA变化趋势一致；7、Real-time PCR及Western blot检测各实验组大鼠肝组织中NF-κB mRNA及蛋白表达显示：随着肝纤维化程度的加重,肝组织中NF-κB的mRNA表达逐渐增加(P<0.01)；Znpp-IX十预组较6周模型组增加更为明显(P<0.05),而Hemin十预组中的NF-κB mRNA表达则显著下降(P<0.05)。NF-κB蛋白表达与mRNA变化趋势一致。结论：HO-1的诱导表达可以明显减轻肝纤维化大鼠肝脏的炎症反应程度、降低肝组织a-SMA及胶原纤维的表达,减轻肝纤维化；而HO-1阻止肝纤维化进展的肝脏保护作用可能是通过对肝组织中PPARy及NF-κB表达的调控实现的。第二部分血红素加氧酶-1对大鼠肝星状细胞增殖、活化及凋亡的影响目的：研究抑制／诱导HO-1的表达对HSC-T6增殖、活化及凋亡的影响。方法：以活化的HSC-T6为研究对象。不同浓度的Hemin (10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l)及Znpp-IX (5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l)作用于HSC-T6不同的时间(12h,24h,48h),通过MTT比色法检测HSC-T6的增殖情况、台盼蓝拒染实验观察细胞存活率及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验观察药物对细胞的毒性作用,以此筛选出Hemin或Znpp-IX发挥诱导／抑制HO-1表达效应的最适浓度及作用时间用于后续实验。实验分组：空白对照组、Hemin干预组、Znpp-IX干预组及Hemin+Znpp干预组。采用MTT法检测各实验组HSC-T6的增殖情况；ELISA方法检测HSC-T6上清液中HA及PⅢP含量；免疫细胞化学技术检测HSC-T6中HO-1及α-SMA的分布与表达；Real-time PCR检测HSC-T6中HO-1及α-SMA的mRNA表达；Western blot检测HSC-T6中HO-1及α-SMA蛋白表达;TUNEL法及AnnexinV-FITC/PI联合标记流式细胞术检测HSC-T6的凋亡；Real-time PCR检测HSC-T6中抗凋亡蛋白Bcl-2及Caspase-3的mRNA表达。结果：1、HO-1的诱导剂Hemin对HSC-T6增殖发挥抑制作用且无明显细胞毒性的最适浓度为20μmol/l (13μg/ml)。抑制剂ZnPP-IX对HSC-T6增殖发挥促进作用且无明显细胞毒性的最适浓度为10μmol/l (3μg/ml),作用时间选择24h；2、免疫细胞化学技术、Real-time PCR及Western blot对各组HSC-T6中HO-1表达的检测显示：Hemin干预组的HO-1表达范围及强度较正常对照及其他干预组均显著升高(P<0.01)：Znpp-Ⅸ干预组同对照组相比虽无显著差异,但也呈下降趋势；Hemin+Znpp-Ⅸ共同干预组中HO-1的表达范围及强度较单纯Hemin干预组显著下降(P<0.05)；3、免疫细胞化学技术、Real-time PCR及Western blot对各组HSC-T6中α-SMA表达的检测显示：Hemin干预组可见α-SMA表达范围及强度较对照组显著下降(P<0.01),Znpp-Ⅸ干预组则升高(P<0.01)；Hemin+Znpp-Ⅸ共同干预组α-SMA表达范围及强度较单纯Hemin干预组增加(P<0.01)；4、各实验组HSC-T6增殖情况：Hemin干预组HSC-T6的增殖活性(MTT值0.867±0.023)较对照组下降16.15%(P<0.01)；Znpp-Ⅸ组(MTT值为1.161±0.015)较对照组升高12.28%(P<0.01)；Hemin+Znpp-Ⅸ组则比Hemin单独处理组HSC-T6增殖活性升高(P<0.05)；5、各实验组HSC-T6胶原代谢的变化：Hemin干预组细胞上清液中HA及PIIIP含量较对照组显著下降(P<0.01),Znpp-Ⅸ十预组二者均显著升高(P<0.01),而Hemin+Znpp-Ⅸ干预组细胞上清液中HA及PⅢP含量较单纯Hemin干预组升高(P<0.01)；6、TUNEL及AnnexinV-FITC/PI流式细胞术检测各组HSC-T6的凋亡：TUNEL结果显示：Hemin干预组HSC-T6凋亡指数(23.5%±2.02%)较对照组(3.25%±0.63%)增加了6.23倍(P<0.01)；Znpp-Ⅸ干预组(4.00%±0.82%)同对照组相比无显著差异(P=0.574)；而Hemin+Znpp-Ⅸ组凋亡指数(16.25%±1.38%)则较单纯Hemin干预组下降(P<0.01)。流式细胞术检测结果同上述趋势一致；7、Real-time PCR检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Caspase-3的mRNA表达显示：同对照组相比较Hemin干预组Bcl-2mRNA表达显著下降(P<0.05),Caspase-3mRNA表达升高(P<0.01);Znpp-Ⅸ干预组Bcl-2mRNA升高(P<0.05),而Caspase-3mRNA表达下降；Hemin及Znpp-Ⅸ共同干预组中Bcl-2mRNA表达量较单纯Hemin干预组又有所回升(P<0.05),而Caspase-3mRNA的表达则有所下降(P<0.05)。结论：HO-1的诱导表达能够抑制HSC-T6的增殖活性及胶原蛋白的代谢能力；HO-1还能够通过影响凋亡相关蛋白如Bcl-2及Caspase-3的表达来调控HSC-T6的凋亡。第三部分血红素加氧酶-1对大鼠肝星状细胞调控作用的信号分子机制目的：研究抑制/诱导HO-1表达对HSC-T6内PPARγ、NF-κB及下游炎性细胞因子表达的调控作用。方法：实验分组为空白对照组、Hemin干预组、Hemin+GW9662组、Znpp-Ⅸ干预组、Znpp-Ⅸ+罗格列酮组。采用免疫细胞化学技术检测PPARy在HSC-T6中的表达;免疫荧光技术检测NF-κB p65在HSC-T6中的表达；Real time-PCR技术检测HSC-T6中HO-1、PPARy及NF-κB的mRNA表达；Western blot检测HSC-T6中HO-1、PPARy及NF-κBp65的蛋白表达;采用ELISA方法检测各实验组HSC-T6培养上清液中TGF-β1及IL-6的含量。结果：1、Real-time PCR及Western blot检测各组HSC-T6中HO-1的mRNA及蛋白表达：Hemin干预组HO-1表达较对照组明显增加(P<0.01)；Hemin+GW9662组HO-1的mRNA表达较单纯Hemin干预组下降19.96%(P<0.05),蛋白表达下降16.05%(P<0.05)；Znpp-Ⅸ干预组HO-1表达较对照组明显下降(P<0.01)；而Znpp-Ⅸ+罗格列酮组,HO-1的mRNA表达较单纯Znpp-Ⅸ干预组升高18.32%(P<0.05),蛋白表达升高13.7%(P<0.05)；2、Real-time PCR及Western blot检测各组HSC-T6中PPARγ、NF-κBp65的mRNA及蛋白表达：Western blot结果显示：Hemin干预组PPARy表达较对照组升高(P<0.01),NF-κBp65表达则下降(P<0.01)；Znpp-IX干预组PPARy表达较对照组下降(P<0.01),而NF-κBp65表达升高(P<0.01)。Hemin+GW9662同单纯Hemin组比较PPARy表达下降17.78%、NF-κB的表达则升高28.94%(P<0.05);Znpp-Ⅸ+罗格列酮组同单纯Znpp-Ⅸ组比较PPARy表达升高18.6%、NF-κB蛋白表达则下降23.16%(P<0.01)。Real-time PCR的mRNA检测同上述趋势基本一致；3、免疫细胞化学及免疫荧光检测HSC-T6中PPARγ、NF-κBp65的表达：PPARy及NF-κBp65主要定位于HSC-T6细胞核。对照组细胞核PPARy表达微弱；Hemin干预后细胞核PPARy表达明显增强,而应用GW9662预孵育的实验组PPARy表达则较单纯Hemin干预组减弱；Znpp-Ⅸ干预组HSC-T6细胞核中PPARy表达较对照组下降,使用诱导剂罗格列酮预孵育的实验组则可看到PPARy表达较单纯Znpp-Ⅸ干预组略有增加。而NF-κBp65的免疫荧光检测结果则同PPARy变化趋势相反；4、各实验组HSC-T6培养上清液中TGF-β1及IL-6的含量：ELISA检测结果显示,TGF-β1及IL-6在各组的变化趋势一致。Hemin干预组细胞上清液中TGF-β1及IL-6的释放量较对照组明显下降(P<0.01),Hemin+GW9662组则观察到二者较单纯Hemin组均有所增加(P<0.05)；Znpp-IX干预组细胞上清液中TGF-β1及IL-6的释放量较对照组显著升高(P<0.01),Znpp-Ⅸ+罗格列酮组二者的释放量较单纯Znpp-Ⅸ干预组则下降。结论：HO-1抑制活化HSC-T6增殖、诱导活化HSC-T6凋亡的作用同其对PPARγ、 NF-κB表达及下游炎性细胞因子释放的调控有关。
