TSH与脂肪细胞胰岛素抵抗发生的相关性研究

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目的:流行病学研究发现,血清促甲状腺激素(TSH)水平与胰岛素抵抗正相关。然而,血清TSH水平与胰岛素抵抗之间存在相关性的机制目前尚不清楚。研究发现,促甲状腺激素受体(TSHR)不仅存在于甲状腺滤泡细胞表面,在前脂肪细胞和脂肪细胞表面同样检测到TSHR的表达。TSH可以直接与脂肪细胞表面的TSHR结合,发挥甲状腺以外的效应。TSH与TSHR结合后可促进已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,通过环腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)途径分泌白介素-6。然而,升高的TSH是否同样会刺激脂肪细胞分泌肿瘤坏死因子-a(TNF-a),进而下调葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4)表达和转位,导致胰岛素抵抗的发生,尚不清楚。本研究拟探讨TSH是否可促进3T3-L1脂肪细胞TNF-a的分泌,进一步影响脂肪细胞GLUT4表达和转位,参与脂肪细胞胰岛素抵抗发生的慢性非特异性炎症过程。方法:1.动物学研究:OLETF大鼠8只为糖尿病组(DM组),LETO大鼠8只为正常对照组(N组)。42周龄时目内眦取血,酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组大鼠血清TSH水平。股动脉放血处死大鼠,Western blotting方法检测附睾脂肪组织TSHR、Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a、GLUT4的表达。2.细胞学研究:体外诱导3T3-L1前脂肪细胞为成熟脂肪细胞。①采用0.1mIU/ml牛TSH,分别刺激前脂肪细胞和诱导成熟的脂肪细胞,于刺激0-24h,采用ELISA方法检测培养基TNF-a水平,以观察TSH刺激后所产生的效应,以及产生效应的的最佳时间;②以不同浓度牛TSH (0.01mIU/ml 0.1mIU/ml 1mIU/ml)刺激后,检测培养基TNF-a水平,Real time PCR法检测细胞GLUT4 mRNA表达水平、Western blotting方法检测Phospho-NF-κBp65 Ser276的表达水平、GLUT4总蛋白及膜表达水平;③分别以1μM Forskolin及1mIU/ml牛TSH刺激后,检测培养基TNF-a水平;④检测予以1mIU/ml牛TSH刺激,及10μM H89预处理15分钟后,Phospho-NF-KBp65 Ser276蛋白表达水平、及培养基TNF-a水平,免疫共沉淀(Co-IP)法检测IκBα/PKAc复合物的产生;⑤给予Rapamycin 20nM预处理1h后,以1mIU/ml牛TSH刺激后,检测3T3-L1脂肪细胞GLUT4 mRNA表达水平及总蛋白及膜蛋白水平。结果:1.动物学研究:与N组相比,DM组大鼠血清TSH水平升高(P<0.01),DM组大鼠附睾脂肪组织TSHR、Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a蛋白表达水平升高(P<0.05,或P<0.01),GLUT4蛋白水平降低(P<0.01);相关分析显示,大鼠血清TSH水平与附睾脂肪组织Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a蛋白表达水平均呈正相关(P<0.05),与附睾脂肪组织GLUT4蛋白表达水平及IAI均呈负相关(P<0.05,或P<0.01)。2.细胞学研究:①随着TSH刺激时间的延长,诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞培养基内TNF-a浓度呈上升趋势,刺激4h趋于达峰(P<0.05),但该效应未见于前脂肪细胞;②与空白对照组相比,随TSH刺激浓度的增加,培养基中TNF-a水平呈上升趋势(P<0.05);③与1mIU/ml牛TSH刺激组相比,Forskolin刺激组培养基中TNF-a水平无明显变化(P>0.05);④与空白对照组相比,予以10μM H89干预组培养基中TNF-a水平未见升高(P>0.05);⑤随着TSH刺激剂量的增加,Phospho-NF-KBp65 Ser276蛋白表达水平呈上升趋势(P<0.05),H89可以抑制TSH对Phospho-NF-κBp65 Ser276蛋白表达促进作用,与培养基TNF-a水平的变化趋势相同,且予以1mIU/ml牛TSH刺激组,可以检测IκBα/PKAc复合物。予以10μM H89干预组未检出IκBα/PKAc复合物产生;⑥随着TSH刺激浓度的增加,GLUT4mRNA、总蛋白及膜蛋白结果呈下降趋势(P<0.05), Rapamycin可以逆转TSH对GLUT4 mRNA、总蛋白及膜蛋白的下调作用。结论:1.DM大鼠血清TSH水平及附睾脂肪组织TSHR的蛋白表达水平均高于N组,TSH与TSHR结合后可能会参与胰岛素抵抗发生的慢性非特异性炎症过程;2.TSH能够剂量依赖性地促进3T3-L1脂肪细胞TNF-a的分泌;3.TSH与3T3-L1脂肪细胞表面TSHR结合后,可能通过激活cAMP-PKA途径,产生IκBα/PKAc复合物,磷酸化IκB使其构象发生改变,活化NF-κB而诱导NF-κB依赖的TNF-a基因转录,促进TNF-a分泌,进一步下调GLUT4基因、蛋白的表达,并抑制其转位,有可能进一步参与胰岛素抵抗的发生。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-7页
缩略语/符号说明第11-14页
前言第14-17页
    研究现状、成果第14-16页
    研究目的、方法第16-17页
一、糖尿病大鼠脂肪组织TSHR蛋白表达的研究第17-32页
    1.1 对象和方法第17-21页
        1.1.1 DM动物模型建立、分组及取材第17-18页
        1.1.2 两组大鼠附睾脂肪组织蛋白Western blotting检测第18-21页
        1.1.3 统计方法第21页
    1.2 结果第21-25页
        1.2.1 DM大鼠模型第21-25页
        1.2.2 Western Blotting检测大鼠附睾脂肪组织TSHR蛋白表达结果第25页
    1.3 讨论第25-31页
        1.3.1 动物模型的建立第26-27页
        1.3.2 TSHR的结构及其活化的分子机制第27-29页
        1.3.3 TSHR在甲状腺以外组织的表达及可能信号传导通路第29-31页
    1.4 小结第31-32页
二、糖尿病大鼠血清TSH水平与胰岛素抵抗发生相关性研究第32-52页
    2.1 对象和方法第32-38页
        2.1.1 DM动物模型建立、分组及取材第32-33页
        2.1.2 两组大鼠血清TSH浓度的测定第33-34页
        2.1.3 两组大鼠附睾脂肪组织蛋白Western Blotting检测第34-37页
        2.1.4 统计方法第37-38页
    2.2 结果第38-42页
        2.2.1 DM大鼠模型第38页
        2.2.2 大鼠血清TSH检测结果第38-39页
        2.2.3 Western Blotting检测结果第39-41页
        2.2.4 大鼠血清TSH水平与各检测指标相关性分析第41-42页
    2.3 讨论第42-51页
        2.3.1 TSH的概述第42-44页
        2.3.2 胰岛素抵抗概述第44-50页
        2.3.3 TSH与胰岛素抵抗的关系第50-51页
    2.4 小结第51-52页
三、TSH对3T3-L1脂肪细胞GLUT4表达和转位的影响第52-95页
    3.1 对象和方法第52-66页
        3.1.1 3T3-L1细胞的培养及诱导分化第52-55页
        3.1.2 细胞培养基TNF-α浓度的测定第55-56页
        3.1.3 GLUT4mRNA的测定第56-61页
        3.1.4 GLUT4总蛋白、膜蛋白、NF-κ Bp65的Western Blotting检测第61-65页
        3.1.5 I_κB_α/PKAc复合物的免疫共沉淀检测第65-66页
        3.1.6 统计方法第66页
    3.2 结果第66-77页
        3.2.1 3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化第66-67页
        3.2.2 TSH对3T3-L1脂肪细胞TNF-α分泌的影响第67-70页
        3.2.3 TSH对3T3-L1脂肪细胞Phospho-NF-κ Bp65 Ser276的影响第70-72页
        3.2.4 TSH对3T3-L1脂肪细胞GLUT4表达及转位的影响第72-77页
    3.3 讨论第77-93页
        3.3.1 3T3-L1脂肪细胞模型的建立第77-78页
        3.3.2 脂肪细胞与胰岛素抵抗第78-86页
        3.3.3 TSH在脂肪细胞的甲状腺以外效应第86-93页
    3.4 小结第93-95页
全文结论第95-96页
论文创新点第96-97页
参考文献第97-110页
发表论文和参加科研情况说明第110-111页
综述 促甲状腺激素在胰岛素抵抗发生中的作用第111-144页
    综述参考文献第131-144页
致谢第144页
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