急性腹泻患者非伤寒沙门菌的耐药监测和基因分型研究

非伤寒沙门氏菌论文 血清学分型论文 耐药性论文 脉冲场凝胶电泳PFGE论文
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目的检测本地区非伤寒沙门氏菌(NTS)的血清型和抗生素耐药情况,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分析(MLST),确定菌株的同源性和优势流行基因型以及菌株间遗传进化关系。为本地区NTS感染的追踪溯源提供数据参考,为NTS感染的预防控制和治疗提供帮助。方法1、菌株血清学分型和药敏试验:试验菌株分离自天津医科大学第二医院肠道门诊急性腹泻患者粪便标本,收集时间为2012和2013的5-10月份。血清型鉴定按照沙门氏菌血清诊断操作步骤(泰国S&A公司提供)进行,根据测定得到的抗原式确定沙门氏菌的血清型。采用K-B纸片扩散法检测非伤寒沙门菌临床株对17种抗菌药物的耐药性。2、PFGE:提取非伤寒沙门菌菌株全基因组DNA,经限制性内切酶Xbal酶切后进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,对于肠炎沙门氏菌再经限制性内切酶Blnl酶切后进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。3.MLST:分别扩增菌株的7个管家基因(thrA, pure, sucA, hisD, aroC, hemD, dnaN)的核心片段(510bp-894bp),将测序结果提交至国际MLST数据库网站(http://www.mlst.net),获得受试菌株的等位基因图谱及其对应的ST型(Sequence Type,ST)。结果1、共分离45株NTS,血清学分型包括5个血清群、12个血清型,均在A-F群范围内,优势血清群依次为D群和B群,以0:4和0:9为主。血清型包括国内常见的肠炎、鼠伤寒、阿贡纳、山夫登堡、德尔卑、布伦登卢普血清型,国内少见的姆班达卡、蒙得维的亚血清型,以及国内罕见的库卡、格兰扁、菲尔摩雷和奥里塔曼林血清型。优势血清型为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。2、45株NTS对萘啶酸敏感率最低,其次是链霉素、庆大霉素、氨苄西林、四环素、哌拉西林、氯霉素。对左氧氟沙星、阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶敏感率大于90%,对环丙沙星、头孢曲松、头孢噻肟、复方新诺明、氨曲南和亚胺培南敏感率为100%。与萘啶酸敏感株相比,萘啶酸耐药株对环丙沙星及左氧氟沙星敏感性下降。菌株全敏感率为24.44%,单药耐药率为44.44%,多重耐药率达17.78%。肠炎血清型主要为单药耐药,而鼠伤寒血清型则以多重耐药较常见,对氨苄西林、氯霉素、四环素、链霉素呈耐药或中介。3、PFGE产生23种PT型(图谱型),条带数为12到20之间,相似系数为0.56-1,分为4大聚类(A、B、C、D),其中各聚类又包括不同的亚聚类,优势聚类为A1和D1。有11种PT型别包括2株以上分离株,其中肠炎沙门菌PT2和鼠伤寒沙门氏菌PT18为优势PT型,PT2、PT6、PT20、PT22在2012和2013年均被分离出。6株PT2和4株PT18型分别分离自同一日期,6株PT2型肠炎沙门菌被证实为感染暴发。Xbal分为同一型别的11株肠炎沙门菌经BlnI作用后可进一步分为3个型别。用PFGE分型预测血清型,预测与实际血清型一致率占70.9%。4、MLST将45株试验菌株分为13个STs,其中14株肠炎血清型均为ST11,9株鼠伤寒血清型包括6株ST19和3株ST34,1株库卡血清型和4株山夫登堡血清型均为ST14,4株阿贡纳血清型均为ST13,3株布伦登卢普血清型为ST22,3株德尔卑血清型为1株ST40和2株ST71,2株蒙得维的亚为ST26,2株菲尔摩雷血清型为ST46,1株格兰扁为ST358,1株姆班达卡为ST413,1株奥里塔曼林为ST1516。ST11所占比例最多,其次为ST34。序列型之间遗传关系较远,其中德尔卑血清型包括的序列型ST40和ST71遗传学上不相关,而遗传相关的ST14同时包括了山夫登堡血清型和库卡血清型。结论1、本地NTS血清型呈现多样性,肠炎血清型和鼠伤寒血清型为主要血清型,检测出一些国内少见(姆班达卡、蒙得维的亚)和罕见(格兰扁、菲尔摩雷和奥里塔曼林)血清型。2、本组资料显示NTS对三代头孢耐药菌株罕见,但对萘啶酸耐药率较高且多伴有氟喹诺酮(FQs)敏感性降低,对FQs临床经验用药构成威胁。鼠伤寒沙门菌多为MDR,呈现ACST耐药表型。3、PFGE显示PT2和PT18为优势型别。PT2、PT6、PT20、PT22克隆株跨年度存在,其中PT2型别有跨年度流行现象。有11组相同克隆株的出现,证实了1起肠炎沙门菌感染暴发,发现1起疑似鼠伤寒沙门菌感染暴发。对肠炎沙门菌进行Xbal-Blnl双酶切PFGE可提高分辨能力。PFGE分型对血清学分型有预测价值。4、MLST分型显示ST11和ST34为本次研究的主要ST型,ST11-PT2型肠炎沙门氏菌和ST34-PT18型鼠伤寒沙门氏菌可能为本地优势克隆株。血清学分型混淆了遗传学上的无关的菌株,ST分型可更好地反应NTS的遗传进化关系。5、应进一步扩大和加强对本地区NTS耐药监测和分型研究。
中文摘要第4-7页
Abstract第7-9页
缩略语/符号说明第12-14页
前言第14-18页
    研究现状、成果第14-17页
    研究目的、方法第17-18页
一、非伤寒沙门氏菌的血清学分型和药敏分析第18-34页
    1.1 材料和方法第18-22页
        1.1.1 菌株来源第18页
        1.1.2 主要仪器第18-19页
        1.1.3 主要试剂第19页
        1.1.4 菌株的保存第19页
        1.1.5 菌株的分离和生化鉴定第19-20页
        1.1.6 菌株的PCR鉴定第20-21页
        1.1.7 菌株的血清学鉴定第21页
        1.1.8 菌株的药物敏感性试验第21-22页
    1.2 结果第22-28页
        1.2.1 NTS菌株的临床资料第22-23页
        1.2.2 NTS菌株的分离和生化鉴定结果第23页
        1.2.3 菌株的PCR鉴定结果第23页
        1.2.4 菌株的血清学鉴定结果第23-24页
        1.2.5 菌株的药敏试验结果第24-28页
    1.3 讨论第28-33页
    1.4 小结第33-34页
二、非伤寒沙门氏菌的PFGE分析第34-47页
    2.1 材料和方法第34-39页
        2.1.1 菌株来源第34页
        2.1.2 主要仪器第34页
        2.1.3 主要试剂第34页
        2.1.4 主要溶液的配制第34-35页
        2.1.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)第35-39页
    2.2 结果第39-43页
    2.3 讨论第43-46页
        2.3.1 PFGE在NTS感染暴发中的作用第43-44页
        2.3.2 PFGE与血清型的对应关系第44-45页
        2.3.3 肠炎沙门氏菌可选择双酶切第45-46页
    2.4 小结第46-47页
三、非伤寒沙门氏菌的MLST分析第47-57页
    3.1 材料和方法第47-48页
        3.1.1 菌株来源第47页
        3.1.2 试剂和仪器第47页
        3.1.3 方法第47-48页
    3.2 结果第48-53页
        3.2.1 PCR扩增结果第48-49页
        3.2.2 MLST分型结果第49-52页
        3.2.3 STs间的遗传进化关系结果第52-53页
    3.3 讨论第53-56页
    3.4 小结第56-57页
结论第57-58页
参考文献第58-66页
发表论文和参加科研情况说明第66-67页
综述 非伤寒沙门氏菌耐药性和基因分型研究进展第67-78页
    综述参考文献第73-78页
致谢第78页
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