本论文利用高压力技术、荧光光谱学等多种方法研究了菠菜光合作用系统II外周蛋白—23kD蛋白(以P23k表示)以及重组猪胰岛素前体(以rPIP表示)的折叠/解折叠。在P23k的研究中,我们用高压力技术结合荧光光谱学等方法在不同的实验条件下系统地研究了P23k折叠/解折叠。热力学研究表明,该蛋白质对压力非常敏感,极易被高压力解折叠。在20℃,pH 5.5的条件下,180MPa即可使该蛋白质完全解折叠,这个压力远远低于迄今为止有关研究中大多数天然蛋白质完全解折叠所需要的压力。经计算P23k的解折叠的自由能与标准体积变化分别为5.6 kcal/mol和–150.3 ml/mol。研究表明NaCl和蔗糖等蛋白稳定剂确实可以增加蛋白质在压力下的稳定性,但有意思的是,我们发现这种稳定作用的机理除了与Timashiff已提出的NaCl等由于增加了蛋白质分子的表面张力从而可以提高蛋白质的自由能理论有关外,而且还与NaCl等引起的蛋白质解折叠标准体积变化(?Vu)的减少相关。压力跃变(pressure jump)研究揭示该蛋白质的解折叠反应的活化体积为负值(–66.2 ml/mol),而折叠反应的活化体积为正值(84.1 ml/mol),表明该蛋白质的过渡态位于折叠态和解折叠态之间。通过不同温度条件下P23k解折叠动力学的研究表明该蛋白过渡态与解折叠态的热膨胀系数比较接近,却明显大于天然态的热膨胀系数。此外,压力跃变研究也揭示了在不同的实验条件下P23k具有不同的折叠途径。在rPIP的研究中,我们发现bis-ANS—一种可以与蛋白质的疏水区域结合的荧光探针,可以与rPIP和人胰岛素等相互作用,其荧光变化且与rPIP和人胰岛素在折叠/解折叠过程中的构象变化相关。在此基础上,我们以bis-ANS为外源荧光探针,利用荧光光谱学等方法比较详细的研究了rPIP的折叠与解折叠,并将相关结果与人胰岛素等进行了比较。“捕获中间体”结合bis-ANS荧光法与相关的动力学法研究结果表明,在rPIP重折叠过程中,分子中的三个二硫键是依次形成的,乔志松等的研究结果也支持这一结论。我们还发现,与人胰岛素相比rPIP的重折叠速度明显要快,其驰豫时间(relaxation time)约为149秒,而人胰岛素的约为16700秒。有意思的是,在利用stopped-flow方法来研究二硫键的形成过程中,我们发现了在rPIP和人胰岛素原(HPI)重折叠开始后bis-ANS的荧光强度均有一迅速升高并降低的快过程,而在人胰岛素的研究中却没有发现类似过程。利用bis-ANS荧光跟踪rPIP的二硫键还原过程,热力学和动力学的实验结果均表明rPIP分子中的三个二硫键是依次被还原的,同时发现人胰岛素二硫键还原过程亦有类似结果。
