牛乳铁蛋白基因片段在原核细胞中的表达及牛乳铁蛋白肽活性检测

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抗生素耐药性已经成为全球饲料工业和人医药界广泛关注的课题,乳铁蛋白肽成为一种很有前景的抗生素替代物,它由25个氨基酸组成的小肽,源自牛乳铁蛋白氮端(Phe17到Phe41)。由于牛乳铁蛋白肽具有强大的广谱抗菌活性,它在异源表达时对宿主(如大肠杆菌细胞)有很强的毒害作用。本实验的目的是建立一种有效的大肠杆菌原核表达系统,获得无活性的或者无毒害作用的牛乳铁蛋白肽前体。我们合成了牛乳铁蛋白(包含乳铁蛋白肽片段)的DNA片段,可编码牛乳铁蛋白氮端的121个氨基酸。该DNA片段重组到表达载体pET-30a(+)上,重组子转入大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞中。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,转化子表达了一条大约19.2 kDa的牛乳铁蛋白片段,表达量约占宿主蛋白总表达量的30%,用Ni Sepharose High Performance亲和层析柱纯化重组蛋白,目的蛋白经SDS-PAGE检测后仍可见清晰的重组表达产物,与预期目的蛋白产物大小基本相符。然后用胃蛋白酶消化重组蛋白,释放出Lfcin B,并检测到重组Lfcin B的抑菌活力。并模拟在动物胃的强酸环境下,将乳铁蛋白肽从高表达的乳铁蛋白片断中释放。总之,本实验所采用的方法可能为乳铁蛋白肽的便利、低成本生产提供另一可行的方法。

摘要	第5-6页
英文摘要	第6页
中英文缩写	第7-11页
前言	第11-12页
一、文献综述	第12-30页
1. 抗菌肽简述	第12-18页
1.1 抗菌肽的种类、结构及其一般性质	第12-14页
1.1.1 Cathelicidins家族	第13-14页
1.1.2 Defensins家族	第14页
1.2 抗菌肽的作用机理	第14-16页
1.2.1 细胞膜损伤机理	第15页
1.2.2 胞内损伤机理	第15-16页
1.3 影响抗茵肽活性的因素	第16-18页
1.3.1 端残基与功能长度对抗菌肽活性的影响	第16页
1.3.2 带电荷氨基酸对抗菌肽活性的影响	第16-17页
1.3.3 残基置换对抗菌肽活性的影响	第17页
1.3.4 氨基酸构象对抗菌肽活性的影响	第17-18页
1.4 应用前景和面临的问题	第18页
2. 乳铁蛋白肽简述	第18-24页
2.1 乳铁蛋白肽结构	第20页
2.2 牛乳铁蛋白肽作用机制及功能	第20-23页
2.2.1 杀菌、抑菌作用	第21-22页
2.2.2 抗寄生虫	第22页
2.2.3 抗病毒	第22页
2.2.4 抗癌	第22-23页
2.2.5 调控基因表达	第23页
2.3 乳铁蛋白肽应用前景	第23-24页
3. 大肠杆菌表达系统的简介	第24-25页
3.1 大肠杆菌表达系统发展历史	第24页
3.2 大肠杆菌表达系统的构成	第24-25页
3.3 大肠杆菌表达系统的特征及优越性	第25页
4. 研究目的	第25页
5. 研究内容	第25-26页
6. 选题依据及研究意义	第26-28页
6.1 牛乳铁蛋白肽代替抗生素的意义	第26-27页
6.2 牛乳铁蛋白肽对仔猪腹泻的意义	第27-28页
6.3 牛乳铁蛋白肽可提高饲料的抗氧化能力	第28页
7. 实验创新性及预期结果	第28页
8. 研究的技术路线	第28-30页
二、材料与方法	第30-41页
1. 材料和仪器	第30-32页
1.1 材料	第30页
1.2 试剂	第30页
1.2.1 酶	第30页
1.2.2 试剂盒	第30页
1.2.3 核酸及蛋白分子量标准	第30页
1.2.4 主要试剂	第30页
1.3 主要培养基	第30-31页
1.4 主要溶液	第31页
1.5 主要仪器设备	第31-32页
1.6 引物设计与合成	第32页
2. 实验方法	第32-41页
2.1 Lfcin B基因的合成	第32-33页
2.2 E. coli/pET-30a(+)-Lfcin B表达载体的构建	第33-36页
2.2.1 含BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点目的基因片段扩增	第33页
2.2.2 PCR产物和pET-30a(+)质粒的酶切与连接	第33-35页
2.2.3 感受态细胞的转化与阳性克隆的筛选	第35-36页
2.3 重组Lfcin B的转化与表达	第36-38页
2.3.1 提取pET-30a(+)-Lfcin B质粒	第36页
2.3.2 pET-30a(+)-Lfcin B重组质粒E. coli的转化与转化子的筛选	第36-37页
2.3.3 重组Lfcin B的IPTG诱导表达	第37-38页
2.4 重组蛋白包涵体的制备、纯化及溶解	第38页
2.4.1 包涵体的制备	第38页
2.4.2 包涵体的纯化和洗涤	第38页
2.4.3 包涵体的溶解	第38页
2.5 重组蛋白的纯化	第38-39页
2.6 纯化重组蛋白的SDS-PAGE检测	第39页
2.7 重组蛋白的活性检测	第39-41页
2.7.1 胃蛋白酶消化重组蛋白,释放Lfcin B	第39页
2.7.2 牛津杯法测定重组Lfcin B的抑菌活力	第39-41页
三、实验结果与分析	第41-48页
1. 含牛乳铁蛋白基因片段Top10/pUC19-Lfcin B的合成	第41页
2. pET-30a(+)-Lfcin B重组表达质粒构建及鉴定	第41-44页
2.1 含酶切位点Lfcin B基因片段的扩增结果	第41-42页
2.2 pET-30a(+)质粒的双酶切	第42-43页
2.3 含酶切位点Lfcin B基因片段的双酶切结果	第43页
2.4 阳性克隆PCR检测与酶切鉴定	第43-44页
3. E. coli/pET-30a(+)-Lfcin B表达菌株的转化与筛选	第44-46页
3.1 PCR检测转化子	第44-45页
3.2 Lfcin B在E. coli中的表达	第45页
3.3 Lfcin B在E. coli中的表达产物纯化	第45-46页
4. 牛津杯法测定重组Lfcin B的抑菌活力	第46-48页
四、讨论	第48-57页
1. 原核表达宿主菌的选择	第48-49页
2. 关于重组质粒和菌株的保存	第49页
3. 关于大肠杆菌表达外源基因引物的设计	第49-50页
4. 原核表达条件的优化	第50-55页
4.1 关于 mRNA稳定性的讨论	第50-51页
4.2 关于目的蛋白细胞质内表达的讨论	第51-52页
4.3 关于提高表达蛋白的天然空间结构的形成	第52页
4.4 蛋白质的蛋白酶解问题探讨	第52-53页
4.5 选用融合蛋白表达的优势	第53-54页
4.6 培养条件的	第54-55页
5. 目的蛋白的纯化	第55页
6. 关于目的蛋白基因的设计合成	第55-57页
五、结论与展望	第57-58页
1. 研究结论	第57页
2. 展望	第57-58页
2.1 改造Lfcin B的分子结构提高其活性	第57页
2.2 优化Lfcin B工程菌的发酵工艺研究	第57页
2.3 动物饲喂实验	第57-58页
参考文献	第58-65页
附录一	第65-66页
附录二	第66-67页
致谢	第67页

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论文编号ABS878621，这篇论文共67页

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