Rhodococcus sp.R04联苯水解酶催化机制的研究

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α/β水解酶超家族正迅速地成为最大的一类结构相关但功能不同的酶类,并且这类酶都含有一个“亲核类氨基酸-His-酸类氨基酸”的催化三联体以适应不同的生理环境。HOPDA水解酶(2-羟基,6-氧,6-苯基-2,4-己二烯酸水解酶)BphD作为该超家族中的一员,是一类具有C-C键断裂功能的水解酶,参与了细菌对联苯的代谢,并在其代谢途径中具有十分重要的作用。近年来,对其催化机制的研究已成为了该领域的研究热点。根据文献报道及本实验室的前期研究成果,本文对野生型BphD的关键位点以及可能对其催化有重要影响的氨基酸进行了定点突变,构建了突变体的重组质粒。表达产物经Q Sepharose离子柱(Hitrap Q)和Sephacryl S-300两步纯化,得到了纯度较高的酶。在此基础上,对突变体的动力学参数,化学修饰剂对突变体活性的影响以及突变体的二级结构进行了测定。结果表明,各突变体的动力学参数特征为:突变体S110A, H265A和D237A的催化效率为野生型的1/104-1/103;突变体W85A和W219A催化效率分别为野生型的5/18,1/3,而同为色氨酸的突变体,W266A的催化效率只有野生型的1/104。化学修饰剂对突变体S110A, H265A, D237A和W266A的酶活几乎没有影响;而对突变体W85A和W219A却有较大的影响,修饰后,其相对活性仅为对照的10%-30%。突变体的圆二色谱(CD谱)分析表明:与野生型相比,突变体的二级结构没有发生改变。证明Ser110, Asp237, His265是HOPDA水解酶(2-羟基,6-氧,6-苯基二四己二烯酸水解酶;HOPDA hydrolase)催化反应所必需的氨基酸,并提出了Trp266在催化反应中也同样起到了非常关键的作用。对突变体S110A, H265A和W266A的前稳态动力学参数进行了测定,同时,通过光谱扫描法对突变体S110A和H265A的酶-底物复合物进行了检测。前稳态动力学分析显示,在底物的酮基化,C-C键断裂及产物释放一系列的反应中,突变体S110A催化底物快速的酮基化(k1492=100s-1),但是C-C键断裂及产物的释放过程十分缓慢(k2492=0.32s-1, k3492=0.027s-1)突变体W266A的动力学模型与S110A相似(k1492=45.45s-1, k2492=0.27s-1, k3492=0.15s-1)突变体H265A催化底物的酮基化过程十分缓慢(k1492=0.02s-1),其后的C-C键断裂过程也十分缓慢(k2492=0.19s-1)。将前稳态动力学的测定结果与突变体的稳态动力学参数相结合,可以得出:在Rhodococcus. sp. R04BphD中,Ser负责底物C-C键的断裂过程;His参与了底物由烯醇式向酮式结构的变化,以及随后的C-C键断裂过程。突变体S110A和H265A(?)-底物符合物的检测结果证实了对其功能的推测。对突变体W266A的前稳态动力学数据分析表明,Trp对底物C-C键的断裂及产物释放有十分重要的作用,推测在Rhodococcus. sp. R04BphD中,Trp-266与Ser-110一起催化底物C-C键的断裂。通过易错PCR的方法,我们构建了BphD的易错文库,通过对文库序列分析发现,L61-F, P253-L是突变率最高的两个位点,而突变较为集中的区段为氨基酸序歹的0-40,60-100以及160-210。为了提高筛选的效率,我们建立了一种高效又快速的筛选方法——96孔板筛选法。希望通过该实验能够得到一种底物范围扩大或酶活提高的突变酶,为进一步提高BphD的催化效率提供了依据。
中文摘要第10-12页
ABSTRACT第12-13页
第一章 文献综述第14-28页
    1 α/β水解酶超家族第14-18页
        1.1 α/β水解酶的结构第14-15页
        1.2 α/β水解酶的一般特征第15-16页
        1.3 α/β水解酶所催化的反应第16-18页
    2 C-C水解酶家族第18-20页
        2.1 概述第18页
        2.2 C-C水解酶催化机制第18-20页
    3 HOPDA水解酶第20-22页
    4 酶催化机制的研究方法第22-23页
    5 本论文研究的目的和意义第23页
    参考文献第23-28页
第二章 Trp在C-C水解酶催化中的关键角色第28-38页
    1 材料与方法第28-31页
        1.1 材料第28-29页
        1.2 水解酶的定点突变第29-30页
        1.3 突变酶的表达纯化第30页
        1.4 水解酶的酶活测定第30页
        1.5 动力学参数的测定第30页
        1.6 水解酶的化学修饰第30-31页
        1.7 水解酶的CD谱测定第31页
    2 结果第31-35页
        2.1 HOPDA水解酶序列比对第31页
        2.2 水解酶突变体表达纯化第31-32页
        2.3 突变酶的动力学分析第32-33页
        2.4 突变体的化学修饰第33-34页
        2.5 水解酶的CD谱分析第34-35页
    3 讨论第35-36页
    参考文献第36-38页
第三章 突变酶前稳态动力学分析第38-52页
    1 材料第39页
        1.1 菌株来源第39页
        1.2 试剂与仪器第39页
    2 方法第39-40页
        2.1 2,3-二羟基联苯双加氧酶BphC的制备第39页
        2.2 2-羟基,6-氧,6-苯基-2,4-己二烯酸水解酶突变体的获得第39-40页
        2.3 底物HOPDA的制备第40页
        2.4 BphD非稳态动力学研究第40页
        2.5 BphD酶-底物复合物检测第40页
    3 结果分析第40-49页
        3.1 野生型BphD的非稳态动力学分析第40-42页
        3.2 BphD突变体的非稳态动力学分析第42-47页
        3.3 BphD酶-底物复合物检测第47-49页
    4 讨论第49-50页
    参考文献第50-52页
第四章 水解酶易错文库的构建第52-61页
    1 材料第52-53页
        1.1 菌株和载体第52页
        1.2 培养基第52-53页
        1.3 主要酶和化学试剂第53页
        1.4 主要仪器设备第53页
    2 方法第53-55页
        2.1 BphD基因内部EcoR Ⅰ位点的突变第53-54页
        2.2 R04水解酶易错文库的构建第54-55页
        2.3 筛选方法的建立第55页
    3 结果分析第55-59页
        3.1 BphD基因内部EcoR Ⅰ点的突变第55页
        3.2 易错PCR条件的确定第55-56页
        3.3 易错文库的构建第56-58页
        3.4 联苯水解酶突变体筛选方法的建立第58-59页
    4 讨论第59页
    参考文献第59-61页
小结第61-62页
攻读学位期间取得的研究成果第62-63页
致谢第63-64页
个人简况及联系方式第64-66页
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