第一部分四种新的基因突变导致血友病B分子发病机制研究目的：1.本研究采用PCR技术及DNA直接测序法对11例山西籍汉族无关血友病B(hemophilia B, HB)家系先证者的凝血因子Ⅸ (factor Ⅸ, FⅨ)基因进行了全部外显子及其侧翼序列的检测,以筛选HB患者FⅨ基因缺陷类型并探讨其分子发病机制；2.构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt,为实时观察FⅨ真核表达载体在HEK293细胞中的表达及FⅨ基因突变导致HB的分子发病机制的研究奠定实验基础；3.对三种新的FⅨ基因突变R116Stop(CGA→TGA)合并点突变A-38G(GCA→GGA), C51G(TGT→GGT),6479insert C进行研究,探讨基因型与表型的相关性。研究三种基因突变对FⅨ表达量及功能的影响,旨在从分子水平阐明HB的发病机制；4.对一种新的FⅨ基因小片段插入突变：FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变进行研究,探讨基因型与表型的相关性。研究该基因突变对FⅨ表达量及功能的影响,旨在从分子水平阐明HB的发病机制。方法：1.采集11例HB患者及家系成员的静脉抗凝血,提取基因组DNA; PCR方法对FⅨ基因8个外显子区域及其侧翼序列进行扩增,PCR产物胶回收后采用双脱氧链终止法在ABI3730测序仪上对PCR产物进行测序；2.用Chromas软件将测序结果与正常序列进行比对,寻找基因突变。对异常测序结果进行反向测序及重复测序以证实基因突变；对于检测到的错义突变,对100例正常对照相应区域的PCR扩增及序列测定进行基因多态性的排除分析；3.以pcDNA/FⅨwt质粒为模板,扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框(open reading frame, ORF)区,对pIRES2-ZsGreenl进行EcoR1和BamH1双酶切,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨ ORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；4.针对FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变,采用微卫星位点检测HB先证者及家系成员FⅨ基因5号外显子区域；5.采用基于PCR的定点突变技术构建携带相应突变位点的突变型真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨ;定点突变产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；6.应用转染技术将野生型、突变型FⅨ表达载体分别转染HEK-293细胞,使用激光共聚焦显微镜观察转染效率；7.采用实时定量PCR检测不同位点突变对FⅨ基因mRNA表达水平的影响；8.采用ELISA方法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达量水平；9.采用一期法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达活性水平；10.采用细胞免疫荧光法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达水平。结果：1.通过对11例HB先证者FⅨ基因8个外显子及其侧翼序列的直接测序检测发现了11种基因突变,在11种突变类型中有8种为外显子区域的点突变,其中包括有1例为无义突变R116Stop(CGA→TGA)合并错义突变A-38G(GCA→GGA),其余7例错义突变分别为V181A(GTT→GCT), C336R(TGT→CGT), C51G(TGT→GGT), R-4Q(CGG→CAG), A-21D(GCT→GAT), F32S(TTT→TCT), C361R(TGT→CGT);1例为侧翼序列的剪切位点点突变G20566A(G→A),1例为插入单个碱基突变：6479insert C,1例为小片段插入突变：17784位插入103bp的插入突变；2.经查询国际HB突变数据库及有关文献,证实其中有4种为首次发现：R116Stop(CGA→TGA)合并错义突变A-38G(GCA→GGA), C51G(TGT→GGT),6479insert C, FIX基因17784位插入103bp的插入突变为国际未报道的基因突变。100例健康成人对照样本FⅨ外显子及其侧翼序列直接基因测序结果未发现上述突变,表明上述突变不是FⅨ基因多态性；3.成功构建pIRES2-ZsGreenl/FⅨ wt,为构建FⅨ突变体并研究HB分子发病机制及实时监测FⅨ的转染效率奠定实验基础；4.针对FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变,微卫星位点检测HB先证者及家系成员结果,先证者1和2微卫星位点检测结果可见130、180、233、283bp四个片段。先证者的外祖母、母亲、姨母微卫星位点检测结果可见130、180、233、283bp四个片段,表明该插入突变遗传自母系。先证者2的父亲为正常序列,没有出现233、283bp片段。先证者1的130bp的曲线下面积/233bp的曲线下面积比值为1.69,先证者2的130bp的曲线下面积/233bp的曲线下面积比值为0.29,显示先证者1相比先证者2的130bp片段比例高,验证了先证者1出血症状较先证者2轻的临床表现；5.成功构建R116Stop(CGA→TGA)合并点突变A-38G(GCA→GGA), C51G(TGT→GGT),6479insert C, FIX基因17784位插入103bp的插入突变对应的pIRES2-ZsGreenl/FⅨ突变体；6. R116Stop合并A-38G突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降(p<0.05),一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ：Ag较野生型明显下降(p<0.05),激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低(p<0.05)7.C51G突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降(p<0.05),一期法及ELISA法检测细胞裂解液FIX:C及FlX:Ag较野生型无明显区别(p>0.05),而细胞培养上清液FIX:C及FlX:Ag较野生型明显下降(p<0.05)激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型无明显降低(p>0.05)8.6479InsertC突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降(p<0.05),一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ:Ag较野生型明显下降(p<0.05),激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低(p<0.05)9.FⅨ基因17784位插入103bp突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型无明显下降(p>0.05),一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ:Ag较野生型明显下降(p<0.05),激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低(p<0.05)结论：1.FⅨ基因缺陷是HB的分子发病机制,其基因缺陷具有明显异质性,各外显子及其侧翼序列均存在基因突变,其中最常见的为外显子区域的错义突变；DNA直接测序法是诊断HB及明确其分子发病机制最直接、最精确的方法之一2. R116Stop合并A-38G突变使FⅨ基因EGF-2区产生截短型蛋白,使其蛋白质活性、含量及表达量降低,影响其蛋白质功能,导致了HB的发生,其突变遗传自母系；同时提示在HB患者基因缺陷检测过程中应检测FⅨ所有外显子及其侧翼序列；3.C51G突变导致FⅨ基因EGF-1区第1个二硫键不能正确形成,从而影响了蛋白质的正确折叠和构象形成,导致EGF-1区与EGF-2区之问不能正确形成蛋白质四级结构,其所产生的突变蛋白质受细胞内质量调控体系的调节而可能存在分泌障碍和细胞内滞留并降解,导致了HB的发牛,其为白发突变；4.6479insert C突变,位于2号外显子的GLA区,引起读码框的改变,导致其编码的FⅨ蛋白在36位氨基酸出现终止密码,36位氨基酸为12个Y-羧基谷氨酸残基之一,形成截短型蛋白,使GLA区结构失去完整性,影响FIXa与F Ⅷa结合,导致HB的发生,其突变遗传自母系；5.FⅨ基因17784位插入103bp突变考虑为逆转录转座子在FⅨ基因17784位插入了87个核苷酸的5S rRNA序列,并在其前后正向重复了16个核苷酸序列。插入突变位于FⅨ123位氨基酸后,可能是引起读码框移码,在136位氨基酸处形成截短型蛋白,也可能在翻译过程中切除插入序列时出现错误导致蛋白质翻译错误。同时其不同先证者之间正常序列及异常序列比例不同,导致了不同的临床表现,其基因突变源白于母系遗传。第二部分通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究目的：1.构建真核表达载体pIRES2-ZsGreenl/FⅧwt,为能够实时观察FⅧ真核表达载体在HEK293细胞中的表达,并为FⅧ基因突变导致HA的分子发病机制的研究奠定实验基础；2.分别在FⅧ、FIX基因的5’端、3’端及中间序列中选择发生频率高的无义突变位点(FⅧ: W14X, R1696X, K1827X, R2307X; FIX:R29X, R116X, W194X, R333X)作为研究重点,构建相应的上述FⅧ、FⅨ无义突变体,为后续观察PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用奠定试验基础；3.进行不同浓度氨基糖苷类药物庆大霉素及非氨基糖苷类小分子化合物(PTC124)药物干预,检测药物干预前后无义突变体FⅧ/FⅨ的mRNA、蛋白表达量及活性变化,为重型血友病无义突变的体外促通读作用提供实验数据。方法：1.以pcI/FⅧwt质粒为模板,扩增出目的基因FⅧ的ORF区,对pIRES2-ZsGreen1进行EcoR1和BamH1双酶切,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅧORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；2.采用基于PCR的定点突变技术构建携带相应突变位点的突变型真核表达载体pIRES2-ZsGreenl/FⅧ;定点突变产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；3.采用CCK-8(Cell Counting kit-8)法检测PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的作用48h后增殖和毒性分析,确定PTC124及氨基糖营类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用的药物浓度；4.应用转染技术将野生型、突变型FⅧ、FⅨ表达载体分别转染HEK-293细胞,使用激光共聚焦显微镜观察转染效率,并给与不同浓度氨基糖苷类药物庆大霉素及PTC124药物干预48h；5.采用实时定量PCR检测无义突变型FⅧ、FⅨ在PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素干预前后mRNA表达；6.采用ELISA方法检测无义突变型FⅧ、FIX在PTC124及氨基糖营类药物庆大霉素干预前后FⅧ、FIX基因蛋白的表达量水平；7.采用一期法检测无义突变型FⅧ、FⅨ在PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素干预前后FⅧ、FⅨ基因蛋白的表达活性水平。结果：1.成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅧwt,为构建FⅧ突变体并研究HA分子发病机制及实时监测FⅧ的转染效率奠定实验基础；2.成功构建FⅧ:W14X, R1696X, K1827X, R2307X; FIX:R29X, R116X, W194X, R333X相应的上述FⅧ、FⅨ无义突变体,为后续观察PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用奠定试验基础；3.采用CCK-8法检测PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的作用48h后增殖和毒性分析,其IC50(half maximal inhibitory concentration of a substance)值,分别为庆大霉素：4.23±0.32mM, PTC124:111.585±9.597μM。结合文献报道,据此各选取5个药物浓度进行PTC124(药物浓度为10μM,20μM,40μM,60μM,80μM)及氨基糖苷类药物庆大霉素(药物浓度为0.5mM,1.0mM,1.5mM,2.0mM,2.5mM)对重型血友病无义突变的体外促通读作用研究；4. FIX:R29X, R116X, W194X, R333X中：W194X,R333X无义突变并不影响FⅨ基因表达量,差异无统计学意义(p>0.05)；R29X,R116X在药物促通读作用后,FⅨ基因表达量有不同程度增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。FⅧ:W14X, R1696X, K1827X,R2307X中：R1696X无义突变并不影响FⅧ基因表达量,差异无统计学意义(p>0.05)W14X, K1827X, R2307X在药物促通读作用后,FⅧ基因表达量有不同程度增加,差异具有统计学意义(p<0.05)5.野生型及各突变组分别转染HEK-293细胞后,一期法进行FⅨ:C、FⅧ:C测定。分别以野生型质粒PIRES2-ZsGreen1/FⅨwt、PIRES2-ZsGreen1/FⅧwt转染细胞裂解液中的FⅨ:C、FⅧ：C为100%,促通读药物作用结果与未给药组相比较。结果表明,FⅨ:R29X, W194X,R116X,R333X在庆大霉素2.5mM和PTC-124801μM作用后,FⅨ：C与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。FⅧ:W14X, R1696X, K1827X, R2307X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅧ：C与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义(p<0.05)6.野生型及各突变组分别转染HEK-293细胞后,ELISA法检测FⅨ:Ag、FⅧ:Ag测定,分别以野生型质粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt、pIRES2-ZsGreenl/FⅧwt转染细胞裂解液中的FⅨ:Ag、FⅧ:Ag为100%,促通读药物作用结果与未给药组相比较。结果表明,FIX:R29X, R116X,R333X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅨ：Ag与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义(p<0.05)；W194X在药物作用后,FⅨ：Ag与未给药组相比较差异无统计学意义(p>0.05). FⅧ:W14X, R1696X, K1827X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅧ：Ag与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义(p<0.05)；R2307X在药物作用后,FⅧ：Ag与未给药组相比较差异无统计学意义(p>0.05)结论：1.无义突变主要使FⅧ、FⅨ基因的翻译过程提前终止,产生截短型凝血因子蛋白；同时凝血因子PTC-mRNA稳定性降低,通过NMD途径使其降解,致使凝血因子含量减低,从而导致血友病发生；2.PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的毒性结果提示PTC124的Ⅰ毒性大于庆大霉素,考虑可能PTC124的溶解介质为二甲基亚砜,其细胞毒性所致；3.PTC124和庆大霉素均能够起到促通读作用使得无义突变的mRNA表达量较未给药组有不同程度的增加；同时使得无义突变体的凝血因子蛋白表达量较未给药组有不同程度的增加；其促通读作用均呈一定的剂量依赖性；4.PTC124和庆大霉素在血友病无义突变的促通读作用中具有相似的通读效率。第三部分免疫相关指标检测在原发免疫性血小板减少症的诊断及治疗中的意义目的：1.检测原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)患者及非免疫性血小板减少症患者分泌GPⅡb/Ⅲa (glycoprotein Ⅱb/Ⅲa)抗体B细胞、血小板特异性抗体(GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ)的变化,评价其对诊断ITP及非免疫性血小板减少症的作用及临床意义；2.检测ITP患者T淋巴细胞亚群的变化,以探讨细胞免疫因素在ITP发病机制中的作用及其临床意义；3.对ITP患者进行血小板生成素(thrombopoietin, TPO)含量及网织血小板百分率(the percentage of reticulated platelet, RP%)变化的检测,同时分析二者与血小板的相关性,讨论其在ITP诊断和发病中的意义。方法：1.应用酶联免疫斑点技术(Enzyme-Linked Immunospot Assay, ELISPOT)、改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术(modified Monoclonal antibody immunobilization of platelet antigens assay, MAIPA)分别检测64例ITP患者、33例非免疫性血小板减少症患者及31例正常对照者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数、血.小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPlb/Ⅸ抗体)表达的变化,并比较检测结果；2.应用流式细胞术检测64例ITP患者及31例止常对照者T淋巴细胞亚群的比值并比较检测结果；3.应用夹心酶联免疫吸附法、流式细胞术分别检测64例ITP患者和31例正常对照血小板生成素(TPO)含量及网织血小板百分率(RP%),同时检测其血小板计数(platelet, PLT)及骨髓巨核细胞数。结果：1.新诊断的ITP患者及持续性和慢性ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数(7.6±4.6/105个PBMC,5.3±3.0/105个PBMC)明显高于非免疫性血小板减少症患者(2.2±2.0/105个PBMC, P<0.05)及正常对照组(1.3±0.5/105个PBMC,P<0.05),同时新诊断的ITP组患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数高于持续性和慢性ITP组患者(P<0.05),而非免疫性血小板减少症患者及正常对照组间的差异无显著性(P>0.05)。新诊断的ITP患者及持续性和慢性ITP组患者血小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPlb/Ⅸ抗体)的OD值(0.51±0.11、0.49±0.10；0.48±0.06、0.46±0.09、)高于非免疫性血小板减少症患者(0.37±0.07、0.39±0.11,P<0.05)及正常对照组(0.33±0.06、0.41±0.03,P<0.05),而非免疫性血小板减少症患者及正常对照组间的差异无显著性(P>0.05)。通过ELISPOT法检测分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞对ITP诊断的敏感性为68.75%,特异性为90.91%,高于改良MAIPA法的敏感性(χ2=6.25,P<0.05)。根据ROC曲线,ELISPOT区分ITP患者和非免疫性血小板减少患者的鉴别效度为0.885；2.ITP组CD3+T淋巴细胞百分比(60.88±14.59)、CD4+T淋巴细胞百分比(28.41±10.55)及CD4+/CD8+的比值(1.18±0.59)均明显低于正常对照组(69.89±6.43、35.38±5.05、1.64±0.29)(P<0.05),CD8+T淋巴细胞(27.09±9.86)则显著高于正常对照(22.08±4.54)(P<0.05)；3.ITP患者巨核细胞增多组和正常对照组TPO水平明显低于ITP患者巨核细胞正常组差异有显著性(P<0.05),而二者之间差异无显著性(P>0.05)。ITP组RP比值明显高于对照组差异有显著性(P<0.05)。经相关分析发现,ITP组患者RP%及TPO与血小板数目呈负相关。结论：1.应用ELISPOT方法检测ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞相比MAIPA法检测ITP患者血小板特异性抗体具有更高敏感性及特异性,可提高ITP的实验室诊断水平,对指导临床治疗有一定的临床意义；2.应用ELISPOT方法检测ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞对区分新诊断的及持续性和慢性ITP具有一定意义；3.T淋巴细胞亚群比例失衡和功能的紊乱参与了ITP的发病过程：调节T淋巴细胞亚群的失衡是治疗的一个新方向；4.TPO检测对探讨血小板生成的机制及辅助ITP的诊断有一定意义,可根据TPO检测结果,为ITP患者应用促血小板生成的TPO模拟物的治疗提供相应的理论依据；5.RP可作为ITP患者治疗中血小板恢复的参考指标,同时其对于鉴别血小板减少性疾病具有重要的临床意义。
