[背景和目的]斯氏狸殖吸虫是我国的三种致病并殖吸虫虫种之一,亦是广泛分布于云南省的最主要致病虫种。斯氏狸殖吸虫虫体长期在肝脏寄生,可能导致肝脏的纤维化病变,肝纤维化逐渐加重,发展为不可逆转的肝硬化,给患者造成严重的危害。因此,研究斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化作用机制,寻找对其治疗的有效药物和新的治疗措施,对斯氏狸殖吸虫病的防治具有重要的意义和价值。斯氏狸殖吸虫童虫具有游走性从而产生异位病变。它可移行至肝脏、脑、脊髓、眼等器官,引起一系列特有症状及病变。肝脏是受损的主要器官,已引起临床工作者的高度重视。虽然在肝型斯氏狸殖吸虫病的病理、发病机制、诊断等研究方面已取得一些进展,但对肝型斯氏狸殖吸虫病肝纤维化的系统研究尚未见报道。因此,研究斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化作用,为寻找斯氏狸殖吸虫致肝纤维化防治的新措施提供理论和实验依据。研究表明,细胞因子在肝纤维化的形成过程中起重要作用。T辅助细胞(Th细胞)是肝内细胞因子的重要来源。Th1细胞分泌IFN-γ,为抗肝纤维化细胞因子,而Th2细胞分泌IL-4,为促肝纤维化细胞因子。Th1/Th2细胞因子之间的平衡失调在肝纤维化的发生中起重要作用。因此,本研究从Th1/Th2细胞因子之间的平衡失调方面,研究斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化作用机制。三氯苯达唑是目前临床治疗斯氏狸殖吸虫感染杀灭虫体效果较好的药物。然而,临床应用三氯苯达唑的剂量差异较大,因此,本研究从形态学和病理形态学方面评价三氯苯达唑对斯氏狸殖吸虫感染实验动物的杀虫效果,确定三氯苯达唑治疗斯氏狸殖吸虫童虫感染的最适剂量,为临床应用提供理论和实验依据。最近有研究发现即使去除了致病因子,很多情况下肝纤维化的进程仍在延续发展。因此,除了应用三氯苯达唑杀虫治疗外,还需要进一步抗肝纤维化治疗。有研究表明,苦胆草具有抗肺纤维化和抗肝损伤作用。因此,本研究选用中药苦胆草治疗斯氏狸殖吸虫引起的肝纤维化,阐明其药理学作用机制,为治疗斯氏狸殖吸虫致肝纤维化提供新的药物。综上所述,本研究应用病理形态学、免疫组化和分子生物学方法和技术,在复制的斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化的模型上,从整体水平、细胞水平和分子水平研究斯氏狸殖吸虫致肝纤维化作用机制和治疗,为防治斯氏狸殖吸虫致肝纤维化提供理论和实验依据。[方法]本研究分四个部分：1.斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化的实验研究方法：对实验用的SD大鼠分别应用病理形态学(光学显微镜、电子显微镜)、生物化学等方法,观测各组大鼠肝脏病理形态学、肝功能的动态变化。从不同方面评价斯氏狸殖吸虫对大鼠肝脏的损害情况,总结大鼠感染斯氏狸殖吸虫后肝脏功能及形态改变方面的特点,为临床上早期诊断该病提供科学依据。2. IL-4, INF-γ在斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化的形成作用机制研究方法：对实验用的SD大鼠分别应用病理形态学、免疫组化等方法,观测各组大鼠的肝组织病理形态学、IL-4和INF-γ在斯氏狸殖吸虫病大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达变化。评价IL-4和INF-γ在斯氏狸殖吸虫感染大鼠肝纤维化形成及调节中的作用。3.三氯苯达唑治疗大鼠斯氏狸殖吸虫感染的实验研究方法：对实验用的SD大鼠分别应用病理形态学(光学显微镜、电子显微镜)、形态学(计数虫体回收数、计算检获虫率及活虫减少率,显微测量虫体长与宽、称虫体湿重)等方法,观测各组大鼠的斯氏狸殖吸虫虫体病理形态学变化,评价不同剂量三氯苯达唑治疗大鼠斯氏狸殖吸虫童虫感染的疗效,以及量效关系的规律性。4.苦胆草治疗斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化的实验研究方法：对实验用的SD大鼠分别应用病理形态学、免疫组化、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,观测各组大鼠的肝组织病理形态学、COL-Ⅰ, COL-Ⅲ, TIMP-1蛋白水平和mRNA表达的变化,评价斯氏狸殖吸虫感染大鼠经三氯苯达唑杀虫治疗后是否需要进一步抗纤维化治疗；评价苦胆草对斯氏狸殖吸虫所致肝纤维化的治疗效果。[结果l1.斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化的实验研究：①肝组织光学显微镜病理形态学变化：感染1周,肝细胞水肿,少数肝细胞脂肪变性,无明显肝细胞坏死,门管区无纤维增生；感染2周,肝脏急性化脓性炎症,在肝组织内形成小脓肿；感染4周,大鼠肝小叶结构仍较完整,但肝细胞气球样变性、坏死及炎症细胞浸润较2周明显；感染6周,大鼠肝小叶结构仍完整,但肝组织内形成小脓肿并出现片状坏死,门管区嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润,少量纤维结缔组织增生；感染8周,肝组织内出现片状纤维组织增生；感染52周,门管区显著扩大,纤维及小胆管增生明显,形成团块、条索状。肝脏纤维化改变明显,有大量假小叶形成。②肝组织透射电镜病理形态学变化：感染1周,部分肝细胞水肿、肝细胞脂肪变性；部分肝细胞滑面内质网扩张；血窦淤血,可见少许贮脂细胞。此期肝损害相对较轻；感染2周,肝细胞水肿加重,局部肝组织中有炎性细胞浸润,此期最突出的改变是贮脂细胞增多,肝细胞间出现胶原纤维,此期肝脏开始出现纤维化改变；感染4周,肝细胞气球样变性、坏死及炎症细胞浸润较2周明显,出现片状坏死；感染6周,肝小叶结构仍完整,但肝组织内形成小脓肿并出现片状坏死,门管区嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润,少量纤维结缔组织增生；感染8周,肝细胞出现明显出血、坏死,局部肝组织纤维化明显加重；感染52周,有大量假小叶形成。③肝功能动态检测结果：斯氏狸殖吸虫感染大鼠4、6、8周,出现白蛋白减少,球蛋白增加；感染6、8周,出现ALT与AST活性升高。2. IL-4、INF-γ在斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化的形成作用机制研究：①肝组织光学显微镜病理形态学变化：随着斯氏狸殖吸虫感染大鼠时间的延长,胶原纤维面积比值(S/T)和肝纤维化评级在逐渐增加,肝组织纤维化的程度逐渐加重。②免疫组织化学染色：IFN-γ的表达阳性细胞百分率在1周至8周逐渐增加,8周达到最大,12周到16周又逐渐减少；而IL-4表达阳性细胞百分率在1周至16周呈增加趋势,12周IL-4表达开始增加迅速。3.三氯苯达唑治疗大鼠斯氏猩殖吸虫感染的实验研究：①检获虫率、活虫减少率变化：治疗结束后1天,对照组、低、中、高剂量组组间比较,差异均无显著性(P＞0.05)；治疗结束后第15、22天,除低剂量组与对照组在治疗结束后第15天比较差异无显著性外(P＞0.05),其余各组之间差异均有显著性(P均＜0.01)。②虫体湿重测定：治疗结束后1天,对照组、低、中、高剂量组组间比较,差异均无显著性(P＞0.05)；治疗结束后第15、22天,除中、高剂量组在治疗结束后第15天比较无显著性差异外(P＞0.05),其余各组组间比较均有显著性差异(P＜0.01)。③虫体大小测量结果：治疗后第1天,对照组、低、中、高剂量组虫体长与宽分别两两比较无显著性差异(P＞0.05)；治疗后第15、22天,除治疗结束后第15天低、中、高剂量组虫体长与宽两两比较差异无显著性外(P＞0.05),其余各组之间差异均有显著性(P＜0.05)。④光学显微镜病理形态学变化：低剂量组体壁、肠管水肿；中剂量组,外皮层剥离,平滑肌裸露,部分皮层细胞变性坏死崩解,肠上皮胞体明显脱落减少；高剂量组,体壁仅见肌层,皮层细胞坏死崩解,实质细胞间质高度水肿疏松,肠上皮几乎全部脱落,仅见肠壁基底膜。⑤电子显微镜病理形态学变化：三氯苯达唑对童虫体壁和肠管的超微结构有不同程度的破坏,低剂量组对虫体的影响比较轻微,中剂量组对虫体的破坏作用比低剂量组强,但未达致死性的剂量,而高剂量组对虫体的破坏是致死性的。对照组大鼠检获的虫体未发现改变。4.苦胆草治疗斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化的实验研究：①肝组织光学显微镜病理形态学变化：三氯苯达唑杀虫组治疗后肝纤维化程度改善不明显,COL-Ⅰ, COL-Ⅲ, TIMP-1蛋白水平下降不明显,与模型组无差异(P＞0.05)；与模型对照组相比,苦胆草组能明显改善肝脏的病理学改变,减少胶原沉积,肝纤维化评分明显降低(P＜0.05)。②免疫组织化学染色和mRNA表达显示苦胆草组COL-Ⅰ, COL-Ⅲ, TIMP-1阳性面积比值明显减小,与模型对照组相比有统计学差异(P＜0.05)。[结论]1.斯氏狸殖吸虫感染能引起大鼠肝脏功能损害,主要表现为血清白蛋白含量减少、血清球蛋白含量增加和血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性升高。2.斯氏狸殖吸虫感染能引起大鼠肝脏组织发生纤维化性病变,其肝脏组织超微结构变化为细胞和细胞器结构发生改变。感染2周贮脂细胞增多,肝细胞间出现胶原纤维,透射电镜作为斯氏狸殖吸虫病肝纤维化早期诊断有一定的价值。3.斯氏狸殖吸虫虫体机械性损伤肝脏和Th1/Th2失平衡是引起大鼠肝纤维化发生的重要因素。4.IL-4和IFN-γ在斯氏狸殖吸虫感染大鼠致肝纤维化形成过程中表达增加,其纤维化病变程度与感染时间、IL-4和IFN-γ的表达增加有关。5.三氯苯达唑对大鼠斯氏狸殖吸虫童虫感染疗效显著,且疗效随着治疗时间的延长和剂量的增加而明显提高。三氯苯达唑治疗大鼠斯氏狸殖吸虫童虫感染最适剂量为200mg/kg.d。6.三氯苯达唑杀灭斯氏狸殖吸虫的作用机理可能与其破坏虫体体壁,破坏虫体肠管组织,导致消化、吸收、分泌、排泄等生理功能和生化代谢障碍有关。7.三氯苯达唑单纯杀虫治疗斯氏狸殖吸虫感染大鼠,不能阻止肝纤维化继续发展,需要进一步进行抗纤维化治疗。8.苦胆草能够抑制肝胶原合成、促进胶原降解,下调TIMP-1蛋白和mRNA表达水平,具有抗肝纤维化作用。9. TIMP-1可能是苦胆草治疗斯氏狸殖吸虫肝纤维化干预作用的一个潜在靶点。
