酿酒葡萄紫檀芪防御酸腐菌的机制研究

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酸腐病是近年来发现的果实成熟后和储藏运输过程中主要病害之一,不仅引起酿酒葡萄采后期烂果发生,而且还严重影响酿酒葡萄及其产品的质量。葡萄酸腐病是由酸腐菌(Geotrichumcitri-aurantii)引起的,目前,对于酸腐菌的防治主要是应用化学杀菌剂,但是这种化学方法不仅会导致耐药菌株的产生,而且残留在水果表面的杀菌剂会严重危害人类健康。近几年来,植保素受到人们更多的关注。紫檀芪就是葡萄在抵御外界生物或非生物压力下产生的一种重要的植保素。前期通过体外抑菌实验发现紫檀芪能高效抑制酸腐菌活性,然而葡萄中紫檀芪对酸腐菌的防御机制尚不清楚,故本实验围绕葡萄紫檀芪防御酸腐菌的机制进行了研究,分离并鉴定了葡萄防御酸腐菌的次级代谢产物,克隆并分析了紫檀芪防御酸腐菌的关键基因,并对关键基因的功能进行验证,研究结果包括以下四个方面:1.通过体外平板抑菌实验来探究不同浓度的紫檀芪对酸腐菌的抑制情况,结果表明,随着紫檀芪浓度的增加,抑制效果明显增强,当紫檀芪浓度为400 μg/mL时,抑制率达到79.91%。为探究葡萄体内紫檀芪对酸腐菌的防御情况,用酸腐菌侵染葡萄,从生理水平观察葡萄腐烂情况。研究发现侵染48h时,葡萄开始发生腐烂,并伴有腐烂酸臭气味发出;侵染72h后,葡萄严重腐烂。为抵御病害侵染,葡萄自身会产生次级代谢产物,通过超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UHPLC-QQQ-MS2)技术分离得到两种主要的防御产物白藜芦醇和紫檀芪,并对侵染前后其含量进行检测来探究这些代谢产物在防御过程中的变化,结果表明通过酸腐菌侵染显著提高葡萄中白藜芦醇和紫檀芪含量。2.根据相关报道并结合已有的葡萄EST数据库,我们克隆了紫檀芪防御的关键基因白藜芦醇氧-甲基转移酶基因(WgREOM),序列分析表明WgREOM开放阅读框为1116bp,编码305个氨基酸,分子量为34.4 kDa,等电点6.52。进化关系分析表明WgREOM与欧洲葡萄VvROMT属于同一亚家族,并与月季RcOOMT的亲缘关系较近。氨基酸序列同源性比对结果显示WgREOM与欧洲葡萄VvROMT具有95.86%的同源性,与中国月季RcOOMT1、蓖麻RsOMT和荷兰鸢尾IhOMT的同源性分别是65.61%、62.10%和30.57%。3.用酸腐菌侵染葡萄,通过荧光定量PCR技术检测目的基因WgREOM在紫檀芪防御酸腐菌的过程中做出的的响应。结果表明WgREOM基因的表达随侵染时间而变化,呈现出先升高后降低的趋势。当侵染24 h时,目的基因WgREOM表达量达到最高,48 h后表达量迅速降低,侵染72 h时几乎不表达。4.利用真核表达系统和HPLC技术对目的基因的功能进行体外验证。首先构建真核表达载体pPIC9K-REOM,并把含有目的基因WgREOM的载体转进毕赤酵母表达系统,对其进行诱导表达,使用SDS-PAGE和Western blot技术检测到相应蛋白,大小约为34.4kDa。之后向含有重组酵母的BMGY培养基中饲喂底物,利用HPLC技术检测到了紫檀芪,在体外证明了 WgREOM具有氧甲基化功能催化产生紫檀芪。
摘要第3-5页
Abstract第5-7页
第一章 文献综述第11-19页
    1 葡萄简介第11-12页
    2 芪类化合物简介第12-13页
    3 芪类化合物的生物活性第13-16页
        3.1 抗菌作用第13-14页
        3.2 抗癌作用第14页
        3.3 抗氧化作用第14-15页
        3.4 降血脂作用第15-16页
    4 葡萄酸腐病简介第16-17页
    5 本文研究的意义及内容第17-19页
第二章 葡萄防御产物的分离和鉴定及关键基因克隆和分析第19-41页
    第一节 葡萄酸腐病防御产物的分离及鉴定第19-29页
        1 前言第19页
        2 实验材料第19-21页
            2.1 主要仪器第19-20页
            2.2 主要试剂第20页
            2.3 试验材料第20-21页
            2.4 供式菌种第21页
        3 实验方法第21-23页
            3.1 紫檀芪对酸腐菌的体外平板抑菌实验第21页
            3.2 酸腐菌针刺侵染葡萄第21-22页
            3.3 葡萄果实中芪类化合物的提取第22页
            3.4 葡萄果实中的芪类化合物的鉴定第22-23页
        4 结果与分析第23-27页
            4.1 不同浓度的紫檀芪对酸腐菌的平板抑菌结果第23-24页
            4.2 酸腐菌侵染葡萄后腐烂情况第24-25页
            4.3 葡萄果实内芪类化合物的鉴定第25-26页
            4.4 葡萄果实内芪类化合物的含量变化第26-27页
        5 讨论第27-29页
    第二节 紫檀芪防御关键基因的克隆及分析第29-41页
        1 前言第29页
        2 实验材料第29-31页
            2.1 主要仪器第29-30页
            2.2 主要试剂及试剂盒第30页
            2.3 引物第30-31页
        3 实验方法第31-34页
            3.1 葡萄总RNA提取及第一链cDNA的合成第31页
            3.2 防御关键基因的扩增第31-32页
            3.3 回收产物的T连接及转化第32-33页
            3.4 重组质粒的提取、鉴定及测序分析第33-34页
            3.5 目的基因的序列分析第34页
        4 结果与分析第34-36页
            4.1 目的基因PCR扩增结果第34-35页
            4.2 目的基因的序列分析第35页
            4.3 氨基酸序列同源性比对第35页
            4.4 进化关系分析第35-36页
        5 讨论第36-39页
        6 本章小结第39-41页
第三章 目的基因在酸腐菌胁迫下的表达分析及体外验证第41-59页
    1 前言第41页
    2 实验材料第41-44页
        2.1 主要仪器第41-42页
        2.2 主要试剂及试剂盒第42-43页
        2.3 菌株及载体第43页
        2.4 试验材料第43页
        2.5 引物第43-44页
    3 实验方法第44-51页
        3.1 酸腐菌针刺侵染葡萄第44页
        3.2 总RNA的提取及第一链cDNA合成第44页
        3.3 qRT-PCR验证WgREOM在葡萄体内防御酸腐菌的响应第44-45页
        3.4 数据处理第45页
        3.5 目的基因连接pGM-T载体及鉴定第45页
        3.6 真核表达载体pPIC9K-REOM的构建第45-47页
        3.7 重组质粒转化毕赤酵母GS115第47-49页
        3.8 重组酵母的诱导表达第49页
        3.9 表达产物的SDS-PAGE及Western blot分析第49-50页
        3.10 表达产物的HPLC分析第50-51页
    4 结果与分析第51-55页
        4.1 WgREOM基因在防御酸腐菌过程中的表达情况第51页
        4.2 重组载体pGM-T-REOM的鉴定第51-52页
        4.3 真核表达载体pPIC9K-REOM的鉴定第52-53页
        4.4 验证重组蛋白在体外酵母的表达第53-54页
        4.5 重组蛋白在防御中生物学功能的验证第54-55页
    5 讨论第55-56页
    6 本章小结第56-59页
第四章 结论第59-61页
    1 主要研究成果第59页
    2 创新点第59页
    3 后续展望第59-61页
参考文献第61-73页
致谢第73-75页
攻读学位期间的研究成果第75页
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