对虾传染性肌肉坏死病毒PCR检测方法建立及样品检测
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对虾传染性肌肉坏死病(Infectious myonecrosis,IMN)是近几年出现的感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的疾病,该病的病原是一种双链RNA病毒——对虾传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV)。该病2002年首次暴发于巴西的凡纳滨对虾养殖场,并迅速在巴西东北部沿岸地区迅速传播蔓延,2006年,经由非法的从巴西进口虾苗的途径,传至印度尼西亚东爪哇省。感染IMNV的病虾在腹部末端体节及尾扇肌肉部位出现白色斑点,在整个养殖季节出现慢性死亡,累积死亡率可达70%。因此,IMN给对虾养殖业造成了巨大的经济损失,自2002至2006年给巴西水产养殖业造成超过1亿美元的损失,至2010年给印度尼西亚造成超过100万美元的损失。由于IMN带来的巨大经济损失,国际兽医局(OIE)在2005年将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病。目前针对IMN还未发现有效的治疗方法,因此,对该病害主要以防为主,建立快速又灵敏的检测方法十分必要。本研究建立了IMNV的一步RT-PCR检测方法、TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对部分地区的凡纳滨对虾样品做了IMNV检测,进行了IMN的流行病调查。主要内容及结果如下:1.建立了IMNV一步RT-PCR检测方法。根据IMNV的全基因序列(GenBankaccession no.AY570892),设计四对引物,从中筛选出灵敏度最高的特异性引物IMNV-F(5′-G G A C C T A T C A T A C A T A G C G T T G C A-3′)和IMNV-R (5′-A A C C C A T AT C T A T T G T C G C T G G A T-3′),可扩增产生134bp的DNA片段,最终检测灵敏度达104拷贝。2.建立了一种IMNV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。设计一对特异性引物IMNV-F (5′-G A T G G C A G C A C G T C A A A A T G-3′)和IMNV-R (5′-C A G C T GT T C C T G G G A C T T C C T-3′)和TaqMan荧光探针(5′-C T A T T T C C T C C A C TA A T T C A G A G C-3′,89–122bp in GenBank AY570892),可扩增产生101bp的DNA片段,引物和探针对IMNV有高度特异性,不与对虾白斑综合征病毒(White spotsyndrome virus, WSSV)、肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvo-like virus, HPV)、斑节对虾杆状病毒(Penaeus monodon baculovirus, MBV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hppodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、健康虾DNA出现交叉反应。本研究建立了一种含有IMNV靶序列的质粒用于实时荧光定量PCR灵敏度的确定,其检测灵敏度达1拷贝的IMNV cDNA克隆质粒。3.采集了来自山东、福建、广东、江苏、浙江等省份的凡纳滨对虾样品631个,利用已建立的一步RT-PCR方法进行IMNV检测,检测结果都为阴性。说明这些地区并未有IMN的大肆流行。
摘要 | 第5-7页 |
Abstract | 第7-8页 |
第一章 综述 | 第13-23页 |
1 PCR 技术在对虾病毒检测中的应用 | 第13-20页 |
1.1 常规 PCR | 第13-14页 |
1.2 套式 PCR | 第14-15页 |
1.3 多重 PCR | 第15-16页 |
1.4 PCR 法制备探针 | 第16页 |
1.5 实时定量 PCR | 第16-19页 |
1.5.1 TaqMan 实时荧光定量 PCR | 第17-18页 |
1.5.2 荧光染料实时定量 PCR | 第18-19页 |
1.6 PCR-ELISA | 第19-20页 |
2 对虾传染性肌肉坏死病毒的研究进展 | 第20-23页 |
2.1 病原 | 第20页 |
2.2 流行地区 | 第20页 |
2.3 外观症状和病理变化 | 第20-21页 |
2.4 检测方法 | 第21-23页 |
第二章 IMNV RT-PCR 检测方法的建立与优化 | 第23-43页 |
1 材料与方法 | 第23-34页 |
1.1 材料 | 第23页 |
1.2 试剂 | 第23-24页 |
1.3 实验仪器 | 第24页 |
1.4 IMNV 阳性组织 RNA 的提取 | 第24-25页 |
1.5 IMNV 阳性组织的套式 PCR 法确认检测 | 第25-26页 |
1.5.1 外引物扩增 | 第25-26页 |
1.5.2 内引物扩增 | 第26页 |
1.6 传染性肌肉坏死病毒 RT-PCR 检测引物的筛选 | 第26-28页 |
1.6.1 引物的设计与合成 | 第26-27页 |
1.6.2 四对引物对 IMNV 的 RT-PCR 扩增 | 第27-28页 |
1.7 传染性肌肉坏死病毒阳性克隆的制备 | 第28-32页 |
1.7.1 总 RNA 的 RT-PCR 反应及 RT-PCR 产物纯化 | 第28-29页 |
1.7.2 LB 培养基的配置 | 第29页 |
1.7.3 活化菌种 | 第29页 |
1.7.4 CaCl_2法制备感受态细胞 | 第29-30页 |
1.7.5 连接反应及转化 | 第30页 |
1.7.6 蓝白斑筛选及白斑的扩大培养 | 第30页 |
1.7.7 转化子的 PCR 鉴定 | 第30-31页 |
1.7.8 阳性重组质粒测序 | 第31页 |
1.7.9 阳性重组质粒的纯化及拷贝数的测定 | 第31-32页 |
1.8 一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的优化 | 第32-34页 |
1.8.1 一步 RT-PCR 检测方法退火温度优化 | 第32-33页 |
1.8.2 一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的确定 | 第33-34页 |
2 结果 | 第34-41页 |
2.1 提取的 RNA 的质量检测结果 | 第34页 |
2.2 IMNV 阳性组织的套式 PCR 检测结果 | 第34-35页 |
2.2.1 外引物扩增结果 | 第34-35页 |
2.2.2 内引物再次扩增结果 | 第35页 |
2.3 传染性肌肉坏死病毒 RT-PCR 检测引物的筛选结果 | 第35-36页 |
2.4 阳性克隆的制备 | 第36-40页 |
2.4.1 RT-PCR 产物纯化结果 | 第36-37页 |
2.4.2 蓝白斑筛选结果 | 第37页 |
2.4.3 转化子的 PCR 扩增电泳鉴定结果 | 第37-38页 |
2.4.4 阳性重组质粒测序结果 | 第38-39页 |
2.4.5 克隆拷贝数的测定结果 | 第39-40页 |
2.5 一步 RT-PCR 反应灵敏度的优化 | 第40-41页 |
2.5.1 一步 RT-PCR 检测方法退火温度优化 | 第40页 |
2.5.2 优化温度下一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的确定 | 第40-41页 |
3 讨论 | 第41-43页 |
第三章 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立 | 第43-54页 |
1 材料与方法 | 第43-46页 |
1.1 材料 | 第43页 |
1.2 试剂 | 第43页 |
1.3 实验仪器 | 第43-44页 |
1.4 TaqMan 探针及引物的设计 | 第44页 |
1.5 含有目的基因的质粒的制备 | 第44页 |
1.6 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 引物及探针的筛选 | 第44页 |
1.7 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 退火温度的优化 | 第44-45页 |
1.8 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法特异性 | 第45-46页 |
1.9 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法可重复性及灵敏度 | 第46页 |
1.10 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的应用 | 第46页 |
2 结果 | 第46-52页 |
2.1 筛选出的引物、探针及克隆 | 第46-48页 |
2.1.1 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 质粒的扩增结果 | 第46-47页 |
2.1.2 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 质粒的测序结果 | 第47-48页 |
2.2 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 退火温度的优化 | 第48-49页 |
2.3 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法特异性 | 第49-50页 |
2.4 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法可重复性和灵敏度 | 第50-51页 |
2.5 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的应用 | 第51-52页 |
3 讨论 | 第52-54页 |
第四章 凡纳滨对虾样品检测 | 第54-59页 |
1 材料与方法 | 第54-55页 |
1.1 材料 | 第54页 |
1.2 试剂 | 第54页 |
1.3 总 RNA 的提取 | 第54-55页 |
1.4 RT-PCR 检测 | 第55页 |
2 结果 | 第55-57页 |
3 讨论 | 第57-59页 |
第五章 结论 | 第59-60页 |
参考文献 | 第60-72页 |
致谢 | 第72-73页 |
硕士期间取得的成果 | 第73页 |
已整理待投的文章 | 第73页 |
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