对虾传染性肌肉坏死病毒PCR检测方法建立及样品检测

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对虾传染性肌肉坏死病(Infectious myonecrosis,IMN)是近几年出现的感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的疾病,该病的病原是一种双链RNA病毒——对虾传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV)。该病2002年首次暴发于巴西的凡纳滨对虾养殖场,并迅速在巴西东北部沿岸地区迅速传播蔓延,2006年,经由非法的从巴西进口虾苗的途径,传至印度尼西亚东爪哇省。感染IMNV的病虾在腹部末端体节及尾扇肌肉部位出现白色斑点,在整个养殖季节出现慢性死亡,累积死亡率可达70%。因此,IMN给对虾养殖业造成了巨大的经济损失,自2002至2006年给巴西水产养殖业造成超过1亿美元的损失,至2010年给印度尼西亚造成超过100万美元的损失。由于IMN带来的巨大经济损失,国际兽医局(OIE)在2005年将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病。目前针对IMN还未发现有效的治疗方法,因此,对该病害主要以防为主,建立快速又灵敏的检测方法十分必要。本研究建立了IMNV的一步RT-PCR检测方法、TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对部分地区的凡纳滨对虾样品做了IMNV检测,进行了IMN的流行病调查。主要内容及结果如下:1.建立了IMNV一步RT-PCR检测方法。根据IMNV的全基因序列(GenBankaccession no.AY570892),设计四对引物,从中筛选出灵敏度最高的特异性引物IMNV-F(5′-G G A C C T A T C A T A C A T A G C G T T G C A-3′)和IMNV-R (5′-A A C C C A T AT C T A T T G T C G C T G G A T-3′),可扩增产生134bp的DNA片段,最终检测灵敏度达104拷贝。2.建立了一种IMNV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。设计一对特异性引物IMNV-F (5′-G A T G G C A G C A C G T C A A A A T G-3′)和IMNV-R (5′-C A G C T GT T C C T G G G A C T T C C T-3′)和TaqMan荧光探针(5′-C T A T T T C C T C C A C TA A T T C A G A G C-3′,89–122bp in GenBank AY570892),可扩增产生101bp的DNA片段,引物和探针对IMNV有高度特异性,不与对虾白斑综合征病毒(White spotsyndrome virus, WSSV)、肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvo-like virus, HPV)、斑节对虾杆状病毒(Penaeus monodon baculovirus, MBV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hppodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、健康虾DNA出现交叉反应。本研究建立了一种含有IMNV靶序列的质粒用于实时荧光定量PCR灵敏度的确定,其检测灵敏度达1拷贝的IMNV cDNA克隆质粒。3.采集了来自山东、福建、广东、江苏、浙江等省份的凡纳滨对虾样品631个,利用已建立的一步RT-PCR方法进行IMNV检测,检测结果都为阴性。说明这些地区并未有IMN的大肆流行。
摘要第5-7页
Abstract第7-8页
第一章 综述第13-23页
    1 PCR 技术在对虾病毒检测中的应用第13-20页
        1.1 常规 PCR第13-14页
        1.2 套式 PCR第14-15页
        1.3 多重 PCR第15-16页
        1.4 PCR 法制备探针第16页
        1.5 实时定量 PCR第16-19页
            1.5.1 TaqMan 实时荧光定量 PCR第17-18页
            1.5.2 荧光染料实时定量 PCR第18-19页
        1.6 PCR-ELISA第19-20页
    2 对虾传染性肌肉坏死病毒的研究进展第20-23页
        2.1 病原第20页
        2.2 流行地区第20页
        2.3 外观症状和病理变化第20-21页
        2.4 检测方法第21-23页
第二章 IMNV RT-PCR 检测方法的建立与优化第23-43页
    1 材料与方法第23-34页
        1.1 材料第23页
        1.2 试剂第23-24页
        1.3 实验仪器第24页
        1.4 IMNV 阳性组织 RNA 的提取第24-25页
        1.5 IMNV 阳性组织的套式 PCR 法确认检测第25-26页
            1.5.1 外引物扩增第25-26页
            1.5.2 内引物扩增第26页
        1.6 传染性肌肉坏死病毒 RT-PCR 检测引物的筛选第26-28页
            1.6.1 引物的设计与合成第26-27页
            1.6.2 四对引物对 IMNV 的 RT-PCR 扩增第27-28页
        1.7 传染性肌肉坏死病毒阳性克隆的制备第28-32页
            1.7.1 总 RNA 的 RT-PCR 反应及 RT-PCR 产物纯化第28-29页
            1.7.2 LB 培养基的配置第29页
            1.7.3 活化菌种第29页
            1.7.4 CaCl_2法制备感受态细胞第29-30页
            1.7.5 连接反应及转化第30页
            1.7.6 蓝白斑筛选及白斑的扩大培养第30页
            1.7.7 转化子的 PCR 鉴定第30-31页
            1.7.8 阳性重组质粒测序第31页
            1.7.9 阳性重组质粒的纯化及拷贝数的测定第31-32页
        1.8 一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的优化第32-34页
            1.8.1 一步 RT-PCR 检测方法退火温度优化第32-33页
            1.8.2 一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的确定第33-34页
    2 结果第34-41页
        2.1 提取的 RNA 的质量检测结果第34页
        2.2 IMNV 阳性组织的套式 PCR 检测结果第34-35页
            2.2.1 外引物扩增结果第34-35页
            2.2.2 内引物再次扩增结果第35页
        2.3 传染性肌肉坏死病毒 RT-PCR 检测引物的筛选结果第35-36页
        2.4 阳性克隆的制备第36-40页
            2.4.1 RT-PCR 产物纯化结果第36-37页
            2.4.2 蓝白斑筛选结果第37页
            2.4.3 转化子的 PCR 扩增电泳鉴定结果第37-38页
            2.4.4 阳性重组质粒测序结果第38-39页
            2.4.5 克隆拷贝数的测定结果第39-40页
        2.5 一步 RT-PCR 反应灵敏度的优化第40-41页
            2.5.1 一步 RT-PCR 检测方法退火温度优化第40页
            2.5.2 优化温度下一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的确定第40-41页
    3 讨论第41-43页
第三章 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立第43-54页
    1 材料与方法第43-46页
        1.1 材料第43页
        1.2 试剂第43页
        1.3 实验仪器第43-44页
        1.4 TaqMan 探针及引物的设计第44页
        1.5 含有目的基因的质粒的制备第44页
        1.6 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 引物及探针的筛选第44页
        1.7 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 退火温度的优化第44-45页
        1.8 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法特异性第45-46页
        1.9 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法可重复性及灵敏度第46页
        1.10 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的应用第46页
    2 结果第46-52页
        2.1 筛选出的引物、探针及克隆第46-48页
            2.1.1 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 质粒的扩增结果第46-47页
            2.1.2 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 质粒的测序结果第47-48页
        2.2 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 退火温度的优化第48-49页
        2.3 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法特异性第49-50页
        2.4 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法可重复性和灵敏度第50-51页
        2.5 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的应用第51-52页
    3 讨论第52-54页
第四章 凡纳滨对虾样品检测第54-59页
    1 材料与方法第54-55页
        1.1 材料第54页
        1.2 试剂第54页
        1.3 总 RNA 的提取第54-55页
        1.4 RT-PCR 检测第55页
    2 结果第55-57页
    3 讨论第57-59页
第五章 结论第59-60页
参考文献第60-72页
致谢第72-73页
硕士期间取得的成果第73页
已整理待投的文章第73页
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