TGF-β1/Smad信号转导途径在糖尿病肺细胞外基质改变中的作用及GLP-1对其干预效应的研究

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目的糖尿病是一种以高血糖为特征的全身性代谢综合征,其所致各组织、器官的多种慢性并发症是影响糖尿病患者生活质量以及致死、致残的主要原因。长期以来,人们对糖尿病心脏、肾脏、神经以及视网膜等并发症进行了深入细致的研究。然而,有关糖尿病对肺脏的影响研究甚少。前期研究发现,糖尿病大鼠肺细胞外基质异常,肺间质可见促纤维化细胞因子——转化生长因子(TGF)-β1表达显著增加。糖尿病肺细胞外基质的改变是否与TGF-β1/Smad信号转导途径的过度激活有关尚不清楚。国内外有文献报道,应用胰高血糖素样肽(GLP)-1治疗可使自发性2型糖尿病大鼠模型(OLETF)大鼠肺毛细血管内皮细胞基底膜厚度明显降低,db/db小鼠肾脏TGF-β1、Ⅳ型胶原纤维表达显著减少。GLP-1是否可降低肺成纤维细胞TGF-β1分泌,进而下调TGF-β1/Smad信号转导途径,改善糖尿病肺细胞外基质的改变尚未见报道。本研究旨在探讨TGF-β1/Smad信号转导途径在糖尿病肺细胞外基质改变中的作用及GLP-1是否可通过影响肺成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导途径,改善肺细胞外基质,初步探索GLP-1在改善糖尿病肺功能异常中的作用。为人们深入了解糖尿病肺功能异常的发病机制提供基础理论依据。方法1.4周龄OLETF大鼠12只和其同系非糖尿病对照组LETO大鼠8只,在无特定病原体级条件下单笼饲养,饲以标准饲料。大鼠定期行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。至30周龄,共有成模OLETF大鼠8只。继续饲养至42周龄,经股动脉放血处死大鼠,留取肺组织。①HE、Masson染色观察各组大鼠肺组织结构和胶原纤维沉积情况;②western blotting检测各组大鼠肺组织Smad3、Smad7、Ⅲ型胶原纤维的表达;③ELISA检测各组大鼠肺组织TGF-β1的表达。2.培养人胚肺成纤维细胞系(MRC-5)。首先,①RT-PCR检测MRC-5细胞GLP-1受体(GLP-1R)mRNA表达;②提取MRC-5细胞膜蛋白,western blotting检测GLP-1R蛋白表达,印证MRC-5细胞是GLP-1作用的靶细胞。然后,在不同葡萄糖浓度下培养MRC-5细胞,分别给予GLP-1(10nmol/L)干预24、48、72h后提取MRC-5细胞总mRNA和蛋白。①实时荧光定量PCR检测各组MRC-5细胞FN、Ⅲ型胶原mRNA表达;②western blotting检测各组MRC-5细胞TGF-β1、p-Smad3(p-Smad3)、Smad7、纤维连接蛋白(FN)、Ⅲ型胶原蛋白表达;③ELISA检测各组MRC-5细胞培养液中TGF-β1表达。结果1. OLETF大鼠较LETO大鼠肥胖,活动迟缓、懒动、毛色干枯无光泽。成模及实验结束时同周龄LETO大鼠体重、OGTT 0-120min血糖曲线下面积、OGTT同步胰岛素曲线下面积均低于OLETF大鼠(P<0.05)。①HE染色显示LETO大鼠肺泡结构正常,OLETF大鼠肺组织结构紊乱,支气管壁、肺泡壁增厚,肺泡上皮细胞显示不清,肺泡萎缩、塌陷,肺间质和血管周围细胞外基质增多,成纤维细胞增多,并有炎症细胞浸润。②Masson染色显示LETO大鼠肺间质、血管周围有少量胶原纤维。OLETF大鼠肺间质胶原纤维增多,排列紊乱,毛细血管周围胶原纤维增多。③OLETF大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、Ⅲ型胶原蛋白表达显著高于LETO大鼠,Smad7蛋白表达显著低于LETO大鼠(均P<0.05)。OLETF大鼠肺组织TGF-β1与Smad3呈显著正相关(γ=0.853,P<0.05),与Smad7呈负相关(γ=-0.720,P<0.05)。2.在MRC-5细胞中检测到GLP-1R mRNA表达,在其膜蛋白中检测到GLP-1R蛋白表达。高糖状态下MRC-5细胞TGF-β1、p-Smad3蛋白以及FN、Ⅲ型胶原纤维mRNA和蛋白表达均显著增高,Smad7蛋白表达显著降低,细胞培养液中的TGF-β1表达亦显著增高(均P<0.05);给予GLP-1干预后,上述各检测指标均得以逆转,差异有统计学意义(均P<0.05)结论①高血糖可能过度激活了OLETF大鼠肺组织TGF-β1/Smad信号转导途径,导致胶原纤维生成增加,细胞外基质代谢紊乱。②GLP-1可能通过下调TGF-β1/Smad信号转导途径,降低高血糖状态下人胚肺成纤维细胞FN及Ⅲ型胶原纤维表达。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-8页
缩略语/符号说明第11-12页
前言第12-16页
    研究现状、成果第12-15页
    研究目的、方法第15-16页
一、TGF-β1/Smad信号转导途径在OLETF大鼠肺细胞外基质改变中的作用第16-42页
    1.1 对象和方法第16-26页
        1.1.1 实验动物与主要试剂、仪器第16-20页
        1.1.2 实验方法第20-25页
        1.1.3 统计学方法第25-26页
    1.2 结果第26-29页
        1.2.1 实验动物成模情况第26-27页
        1.2.2 HE、Masson染色结果第27-28页
        1.2.3 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、Smad7、Ⅲ型胶原蛋白表达结果第28-29页
    1.3 讨论第29-41页
    1.4 小结第41-42页
二、GLP-1对人胚肺成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导途径的影响第42-75页
    2.1 对象和方法第42-52页
        2.1.1 实验动物与主要试剂、仪器第42-45页
        2.1.2 实验方法第45-51页
        2.1.3 统计学方法第51-52页
    2.2 结果第52-61页
        2.2.1 MRC-5细胞培养第52页
        2.2.2 MRC-5细胞GLP-1受体的鉴定结果第52-54页
        2.2.3 实时荧光定量PCR检测MRC-5细胞纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达结果第54-57页
        2.2.4 western blotting检测MRC-5细胞TGF-β1、p-Smad3、Smad7、纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原蛋白表达结果第57-60页
        2.2.5 ELISA检测MRC-5细胞培养液TGF-β1表达结果第60-61页
    2.3 讨论第61-74页
    2.4 小结第74-75页
全文结论第75-77页
论文创新点第77-78页
参考文献第78-87页
发表论文和参加科研情况说明第87-89页
综述 糖尿病与肺功能异常第89-112页
    综述参考文献第100-112页
致谢第112页
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