5-FU-壳聚糖纳米粒的制备、检测及其对卵巢癌细胞的抑制作用

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壳聚糖(chitosan,CTS)是由甲壳素脱乙酰基所得,化学名:(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖。由于壳聚糖来源丰富,具有无免疫原性、无毒性、无溶血效应、无刺激性、无热源反应,以及良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性、抗肿瘤作用等,使其作为化疗药物载体受到了广泛的关注,被认为是一种极具应用前景的药物载体。5-氟尿嘧啶(5-FU)属抗细胞代谢类抗癌药,其抗瘤谱较广,可用于治疗消化道肿瘤、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌及卵巢癌等。近几年,许多学者致力于壳聚糖的抗肿瘤作用以及将其作为抗肿瘤药物载体的研究。本实验以壳聚糖纳米粒作为药物载体,制备成5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒(5-FU-CN)缓释剂,检测其一般特性,并检测其抗卵巢癌细胞作用。目的1.摸索制备5-FU-CN的实验条件,制备5-FU-CN并检测其一般特性。2.检测5-FU-CN对卵巢癌A2780细胞增殖能力的影响。3.检测5-FU-CN对卵巢癌A2780细胞凋亡的影响。方法1.利用离子凝胶法制备5-FU-CN,摸索不同的CTS与多聚磷酸钠(TPP)质量比,不同质量浓度的CTS溶液,及不同CTS与5-FU质量比对反应体系的影响。利用扫描透射电镜,负染条件下观察CN及负载不同质量5-FU的壳聚糖纳米粒的外形特征。利用体外透析的方法,检测裸药5-FU和5-FU-CN的释放特点。2.利用倒置显微镜观察5-FU-CN作用于卵巢癌A2780细胞后对细胞形态的影响;利用MTT法,检测5-FU-CN对A2780细胞的生长抑制作用,并与裸药5-FU和空白壳聚糖纳米粒(CN)进行比较;利用流式细胞仪检测5-FU-CN作用于A2780细胞后,对其细胞周期分布的影响;利用免疫细胞化学的方法检测5-FU-CN对A2780细胞PCNA表达的影响。3.利用流式细胞仪检测5-FU-CN作用于A2780细胞后,对细胞凋亡的影响;利用TUNEL法进一步检测5-FU-CN对细胞凋亡的影响;利用RealTimePCR方法检测CN对A2780细胞凋亡相关基因(caspase-3,caspase-8,bax,bcl-2)的影响。结果1.固定CTS的浓度为1mg/mL,随着CTS与TPP质量比的增加,反应体系混合液逐渐浑浊,同样固定CTS与TPP的质量比为5:1,随着CTS溶液质量浓度的增加,反应体系溶液出现絮凝、甚至出现浑浊。根据对反应条件的摸索,制备CN及5-FU-CN时,选择CTS的质量浓度为5mg/mL,CTS与TPP的质量比为5:1,CTS与5-FU的质量比为1:1。用透射电子显微镜观察,CN为规则的圆形,表面光滑,其粒径大小在30~60nm范围内,具有良好的稳定性和分散性。包埋5-FU后,纳米粒的粒径随着所含5-FU质量比例增大而增大,且粒径的分布范围变大。体外透析实验证明:裸药5-FU不存在缓释效应,而负载于壳聚糖纳米粒后,5-FU-CN具有一定的缓释效应,缓释时间可长达120h左右。2.倒置显微镜下观察,5-FU-CN作用于A2780细胞后,出现细胞数量减少,胞质浓缩,部分细胞体积明显缩小,轮廓不规则,生长缓慢,随着作用时间的延长,出现多数细胞死亡。MTT实验显示5-FU-CN对A2780细胞具有一定的生长抑制作用,且呈浓度-时间依赖性。与裸药5-FU相比,在药物作用24h之前,5-FU-CN对人卵巢癌细胞A2780细胞的生长抑制作用弱于裸药5-FU,但在24h之后,5-FU-CN对肿瘤细胞的生长抑制作用强于裸药5-FU,且差异具有统计学意义(P<0.05)。间接证明了5-FU-CN的缓释作用。5-FU-CN能够明显抑制A2780细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达(P<0.05)。与此同时5-FU负载于壳聚糖纳米粒后,使处于S期细胞比例下降,G1期细胞比例增加,随着时间的延长,5-FU-CN将细胞抑制于G1期的作用更加明显。3.流式细胞仪及TUNEL法检测结果均证明:5-FU-CN能诱导A2780细胞发生凋亡。裸药5-FU与5-FU-CN相比,在作用24h,5-FU诱导细胞凋亡的能力强于5-FU-CN,在作用48h,5-FU-CN诱导细胞凋亡的能力超过5-FU,且具有统计学意义(p<0.05)。5-FU-CN能够上调A2780细胞中caspase-8、caspase-3、baxmRNA表达量,下调bcl-2mRNA表达量。虽然5-FU-CN对基因的调控速度相对裸药5-FU较慢,但是其调控能力强大,且作用持久。结论1.利用离子凝胶法,选择壳聚糖的质量浓度为5mg/mL,壳聚糖与多聚磷酸钠的质量比为5:1,壳聚糖与5-氟尿嘧啶的质量比为1:1,能够制备出稳定性及分散性好、粒径分布均一的纳米粒。2.5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒中的5-氟尿嘧啶具有药物缓释性能,其缓释过程分为突释阶段和缓释阶段两部分,缓释时间可持续120个小时左右。3.5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒对卵巢癌A2780细胞具有生长抑制作用,呈现浓度-时间依赖性,且其抗肿瘤作用明显强于裸药5-氟尿嘧啶及空白壳聚糖纳米粒。虽然5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒对A2780细胞的生长抑制作用在早期不及裸药5-氟尿嘧啶,但随着作用时间的延长,其抗肿瘤效果明显增强并超过裸药5-氟尿嘧啶,间接证明了5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒的药物缓释作用。4.5-氟尿嘧啶经壳聚糖包埋后能够增加其对A2780细胞G1期的抑制作用,与此同时能抑制A2780细胞内PCNA蛋白表达,从而起到抑制A2780细胞增殖的作用。5.5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒能诱导A2780细胞发生凋亡,且其诱导A2780细胞凋亡的能力随作用时间的延长明显增强,这可能是5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒药物缓释作用的又一表现。6.5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒通过上调A2780细胞中caspase-8、-3、baxmRNA表达量,下调bcl-2mRNA表达量,激活凋亡相关通路,5-氟尿嘧啶-壳聚糖纳米粒对A2780细胞的杀伤作用可通过诱导凋亡途径实现。
缩略语表第5-7页
中文摘要第7-11页
英文摘要第11-15页
前言第16-17页
文献回顾第17-27页
实验一 5-FU-CN的制备及检测第27-37页
    1 材料第27-28页
    2 方法第28-29页
    3 结果第29-34页
    4 讨论第34-37页
实验二 5-FU- CN对卵巢癌细胞增殖能力的影响第37-49页
    1 材料第37-39页
    2 方法第39-41页
    3 结果第41-47页
    4 讨论第47-49页
实验三 5-FU-CN对卵巢癌细胞凋亡的影响第49-59页
    1 材料第49-50页
    2 方法第50-53页
    3 结果第53-58页
    4 讨论第58-59页
小结第59-60页
参考文献第60-68页
个人简历和研究成果第68-69页
致谢第69页
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