Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2转运四氢嘧啶类物质的机制及全基因测序分析
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Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2是一株可以在高盐条件下高效降解苯酚的中度嗜盐菌,可用于强化高盐有机废水的生物处理。中度嗜盐菌在遇到外界渗透压变化时,会通过积累相容性溶质来进行耐盐,而目前对于V.halodenitrificans PDB-F2利用相容性溶质进行耐盐的机制研究还十分欠缺。研究该菌利用相容性溶质的耐盐机制,尤其是利用典型相容性溶质的耐盐机制,对于全面阐明该菌的耐盐机制、指导该菌在废水处理中的应用以及为微生物相容性溶质耐盐机制提供基础性研究数据等方面具有重要意义。本研究首先探究了不同相容性溶质对该菌在高盐条件下的渗透保护效果,结果表明不同相容性溶质对该菌的渗透保护作用依次是羟基四氢嘧啶>四氢嘧啶>脯氨酸>海藻糖>谷氨酸>甜菜碱。利用氢谱核磁共振检测了外源添加相容性溶质时该菌体内积累相容性溶质的情况,结果表明任何一种单一的相容性溶质都不能提供该菌在高盐条件下所需的渗透压,该菌会在体内合成多种相容性溶质进行耐盐,但四氢嘧啶类物质是其积累的主要相容性溶质。利用全基因组测序和基因预测分析技术,鉴定了该菌体内和以上相容性溶质有关的合成基因和转运基因,并对四氢嘧啶类物质的转运基因ehuABCD进行了结构分析。ehuC、ehuD、ehuA三个基因按照同一方向依次串联,与ehuB之间相隔156bp,基因翻译方向为ehuB-ehuC-ehuD-ehuA。利用异源表达功能互补实验进一步验证了ehuABCD和另一个全基因组测序分析鉴定出来的转运基因ehuE的功能,证明了ehuABCD和ehuE基因确实是四氢嘧啶类物质的转运基因。利用高效液相色谱(HPLC)和实时荧光定量PCR技术探究了渗透冲击条件下该菌对四氢嘧啶类物质的表观转运过程和转运基因表达情况。结果发现从8%(w/v)NaCl冲击到12%(w/v)NaCl时,该菌对羟基四氢嘧啶的最大转运速率为7.41 ± 0.37 mg/g细胞干重· min,约是四氢嘧啶最大转运速率(1.65 ± 0.01 mg/g细胞干重· min)的4.5倍;四氢嘧啶转运速率的变化与转运基因表达量的变化趋势一致,都是先增高再降低;盐度对四氢嘧啶的转运过程具有明显的抑制作用(低渗冲击的最大转运速率是高渗冲击时的近20倍);四氢嘧啶的转运过程受到转运蛋白活性和转运基因转录水平的共同调控。
摘要 | 第5-6页 |
Abstract | 第6-7页 |
第1章 前言 | 第11-25页 |
1.1 研究背景与意义 | 第11-12页 |
1.1.1 研究背景 | 第11页 |
1.1.2 研究意义 | 第11-12页 |
1.2 中度嗜盐菌耐盐机制概述 | 第12-15页 |
1.2.1 中度嗜盐菌的定义和分类 | 第12页 |
1.2.2 中度嗜盐菌的特点和应用 | 第12-14页 |
1.2.3 中度嗜盐菌的耐盐机制 | 第14-15页 |
1.3 相容性溶质耐盐机制概述 | 第15-18页 |
1.3.1 相容性溶质种类和作用机制 | 第15-16页 |
1.3.2 中度嗜盐菌的相容性溶质耐盐机理 | 第16页 |
1.3.3 相容性溶质的合成与转运 | 第16-18页 |
1.4 四氢嘧啶类物质的研究进展 | 第18-23页 |
1.4.1 四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶 | 第18-19页 |
1.4.2 四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的合成途径及其调控 | 第19-21页 |
1.4.3 四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的转运过程 | 第21-23页 |
1.5 研究目的及内容 | 第23-25页 |
1.5.1 研究目的 | 第23页 |
1.5.2 研究内容 | 第23-24页 |
1.5.3 技术路线 | 第24-25页 |
第2章 实验材料及分析方法 | 第25-36页 |
2.1 实验试剂及配制方法 | 第25-30页 |
2.1.1 实验试剂 | 第25-27页 |
2.1.2 培养基及其配制 | 第27-29页 |
2.1.3 试剂配制及保存方法 | 第29-30页 |
2.2 实验仪器和设备 | 第30-34页 |
2.2.1 实验仪器/设备 | 第30-31页 |
2.2.2 主要实验仪器/设备及用途 | 第31-34页 |
2.3 分析方法 | 第34-36页 |
2.3.1 四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的分析方法 | 第34-36页 |
第3章 不同相容性溶质对V.halodenitrificans PDB-F2的影响 | 第36-43页 |
3.1 引言 | 第36页 |
3.2 材料与方法 | 第36-38页 |
3.2.1 不同相容性溶质对V.halodenitrificans PDB-F2生长的影响实验 | 第36-37页 |
3.2.2 外加相容性溶质对V.halodenitrificans PDB-F2体内积累相容性溶质的影响实验 | 第37页 |
3.2.3 外源性四氢嘧啶对V.halodenitrificans PDB-F2在不同盐度下生长的影响实验 | 第37-38页 |
3.3 结果与讨论 | 第38-42页 |
3.3.1 不同相容性溶质对V.halodenitrificans PDB-F2在高盐环境中生长的影响 | 第38-39页 |
3.3.2 外源添加不同相容性溶质对V.halodenitrificans PDB-F2体内积累相容性溶质的影响 | 第39-41页 |
3.3.3 四氢嘧啶对V.halodenitrificans PDB-F2在不同盐度下生长的影响 | 第41-42页 |
3.4 本章小结 | 第42-43页 |
第4章 V.halodenitrificans PDB-F2全基因组测序及预测分析 | 第43-55页 |
4.1 引言 | 第43页 |
4.2 材料与方法 | 第43-44页 |
4.2.1 V.halodenitrificans PDB-F2基因组DNA的提取 | 第43-44页 |
4.2.2 V.halodenitrificans PDB-F2全基因组测序和基因预测分析 | 第44页 |
4.3 结果与讨论 | 第44-54页 |
4.3.1 V.halodenitrificans PDB-F2全基因组测序结果和基因预测分析结果 | 第44-49页 |
4.3.2 V.halodenitrificans PDB-F2中相容性溶质合成和转运相关基因的预测结果 | 第49-52页 |
4.3.3 四氢嘧啶类物质转运基因预测结果的结构分析 | 第52-54页 |
4.4 本章小结 | 第54-55页 |
第5章 四氢嘧啶类物质转运基因的功能验证 | 第55-62页 |
5.1 引言 | 第55页 |
5.2 材料与方法 | 第55-58页 |
5.2.1 细菌基因组DNA的提取 | 第55页 |
5.2.2 目的基因PCR扩增和表达质粒构建 | 第55-58页 |
5.2.3 功能互补验证实验 | 第58页 |
5.3 结果与讨论 | 第58-61页 |
5.3.1 目的基因的PCR扩增和表达质粒构建验证 | 第58-60页 |
5.3.2 功能互补实验结果 | 第60-61页 |
5.4 本章小结 | 第61-62页 |
第6章 四氢嘧啶类物质的转运机制 | 第62-73页 |
6.1 引言 | 第62-63页 |
6.2 材料与方法 | 第63-66页 |
6.2.1 高渗冲击下V.halodenitrificans PDB-F2对四氢嘧啶类物质的转运实验 | 第63页 |
6.2.2 低渗冲击下V.halodenitrificans PDB-F2对四氢嘧啶类物质的转运实验 | 第63页 |
6.2.3 四氢嘧啶转运过程的调控水平 | 第63页 |
6.2.4 细菌总RNA的提取 | 第63-64页 |
6.2.5 cDNA第一链合成方法 | 第64-65页 |
6.2.6 实时荧光定量PCR实验 | 第65-66页 |
6.3 结果与讨论 | 第66-71页 |
6.3.1 高/低渗冲击下V.halodenitrificans PDB-F2对四氢嘧啶类物质的表观转运规律 | 第66-68页 |
6.3.2 高/低渗冲击下V.halodenitrificans PDB-F2四氢嘧啶类物质转运基因的表达规律 | 第68-70页 |
6.3.3 四氢嘧啶转运过程的调控水平 | 第70-71页 |
6.4 本章小结 | 第71-73页 |
第7章 结论与展望 | 第73-75页 |
7.1 结论 | 第73-74页 |
7.2 展望 | 第74-75页 |
参考文献 | 第75-82页 |
致谢 | 第82-83页 |
硕士期间相关研究成果 | 第83页 |
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