丙型肝炎病毒多表位抗原的基因合成与免疫原性研究

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的感染呈世界性分布，能引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝细胞癌。目前，全球HCV感染者1.7～2亿人，我国一般人群HCV感染率约为2％，约3800万HCV感染者。成人感染者约50％～80％发展成慢性，其中约20％可发展为肝硬化，1％～4％可发展为肝癌。由于目前无HCV疫苗预防感染，而且，干扰素和利巴韦林联合治疗的应答率约为40％，因此，研制HCV疫苗具有重要的意义。HCV基因组全长一般在9379～9481nt之间，编码一个约含3000个氨基酸的多聚蛋白前体，在宿主和病毒自身蛋白酶的加工下产生结构蛋白(C、E1和E2)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4和NS5等)。HCV感染的最大病理特点为：慢性感染者体内的免疫反应不能有效清除病毒体，病毒以准毒株(quasispecies)形式存在于宿主体内。本研究针对HCV的高度变异及免疫学特点，首先设计合成出HCV多表位抗原基因(multi-epitope fragment combination，mfc)，将其同gst基因融合后原核表达，获得了HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC，分析了HCV多表位抗原融合蛋白的抗原特性。而后，研究了HCV多表位抗原融合蛋白疫苗接种小鼠及家兔诱导特异性免疫反应的情况。同时，引入IL-2的分泌信号肽和通用型辅助性T细胞表位(PADRE)基因，构建了基因排列为信号肽-通用型辅助性T细胞表位-mfc的HCV多表位抗原DNA疫苗，研究了此疫苗接种小鼠的免疫应答情况。并且，尝试性研制了能够复合呈现HCV多表位抗原蛋白的病毒样纳米颗粒性HCV疫苗。一、丙型肝炎病毒多表位抗原基因(mfc)的设计、合成及在大肠杆菌中的表达、纯化与免疫原性研究 在本室前期工作基础上，并参阅文献，我们优选出HCV E2区中HVR1(aa 384～410)模拟B细胞表位9条、C区保守CTL表位2条(aa 35～44，aa 132～140)、NS3区保守CTL表位1条(aa 1073～1081)及NS3区保守Th表位1条(aa 1251～1259)。各表位之间以三个氨基酸为linker连接，人工合成上述13条表位基因串联的HCV多表位抗原基因(mfc)。应用INSIGHT Ⅱ和DNAMAN软件分析了mfc基因中各表位的结构及亲疏水性。将mfc同gst融合后原核表达，筛选获得了高效表达可溶性HCV多表位抗原融合蛋白工程菌并优化了其摇瓶发酵参数，并纯化出HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC。分别用Western-blot和ELISA方法检测了丙肝患者阳性血清与多表位抗原融合蛋白的反应情况及识别反应频率(Reactivity frequency)。结果如下：人工合成的全长为969bp的mfc基因的测定序列同设计序列完全相同：软件分析表明，HCV多表位抗原蛋白(MFC)的结构较松散，所包含的各抗原表位的构象不尽相同，但显示相对独立性；软件预测表明，多表位抗原融合蛋白GST-MFC中的GST为能量较低的球形结构，同MFC融合后不会影响下游MFC的构象，两部分各自保持结构的相对独立性；多表位抗原融合蛋白GST-MFC的表达量约占菌体第二军医大学博士论文蛋白的1一5%，经亲合层析纯化后的获得率为Zmg/7g湿菌;Westem一blot检测显示，融合蛋白GST-MFC中的HCV多表位抗原MFC能与丙肝患者血清发生特异性反应性;ELISA结果表明，20份丙肝患者血清中的巧份能识别HCV多表位抗原MFC(P/N全2.1为标准)，识别反应频率为75%。二、丙型肝炎病毒多表位抗原融合蛋白(GST-MFC)在小鼠及家兔中的免疫应答研究 在上述工作基础上，取昆明种小鼠12只，每组6只，分为免疫组和实验组;取新西兰家兔雌雄各1只，均进行免疫。将多表位抗原融合蛋白以完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂乳化，每隔2周皮下多点注射0.lm岁只·次(小鼠)和lm留只·次(家兔)免疫动物，连续免疫5次。检测免疫后特异性抗体产生、脾细胞特异性刺激增殖反应和细胞因子 IFN叮和IL碑的分泌及DTH反应性等指标。用Westem一blot检测动物免疫血清与多表位抗原融合蛋白的杂交反应情况。用ELISA方法检测抗血清与10条自然感染的HVRI不同变异株合成肤的交叉反应率(cross reactivity)。结果表明:小鼠免疫后第4周即可检测到低水平的特异性抗体，·至第8周升至1:1护。小鼠免疫后第8周，用多表位抗原融合蛋白作为刺激物，测得脾细胞增殖刺激指数为2一4土0.18，sxzo4/loo林L的脾细胞刺激72小时培养液中IFN叮为1508封58pg/ml，而IL一4水平<4 pg/ml(检测闻值)。免疫小鼠和家兔均可诱发明显的Dm反应。大剂量抗原多次免疫家兔可诱发较高滴度的特异性抗体，免疫第6周抗体明显升高，至第10周升至最高，滴度达1:106。westem一blot检测显示免疫小鼠及家兔的抗血清均能与HCV多表位抗原融合蛋白发生反应。EUSA检测家兔第8周免疫抗血清能与自然感染的HVRI不同变异株合成肤10条中的9条发生反应(P加七2.1为标准)，交叉反应率为90%。表明HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC诱导的抗体可能具有中和大多数HCV.流行株的能力，具有开发为HCV预防性疫苗的潜能。三、丙型肝炎病毒多表位抗原基因DNA疫苗的构建及在小鼠中免疫应答研究 为加强DNA疫苗的免疫能力，以质粒pVAxl.O为骨架，构建了基因排列为IL一2信号肤一通用型辅助性T细胞表位州斤的 HCv多表位抗原DNA疫苗，即质粒pVAX 1 .0一sl~刀诉。取BALB/。小鼠12只分为实验组和对照组各6只。质粒DNA经大量抽提纯化后，调?