雌激素调节乳腺癌细胞P2X7受体的机制研究

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雌激素是体内一类重要的类固醇激素,不但对女性乳腺、卵巢、子宫等生殖器官的发育有重要影响,而且在心血管、内分泌激素及骨骼系统中发挥作用。乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。研究表明,体内雌激素水平增高可增加乳腺癌的患病风险。绝经期妇女中其乳腺癌患病率与体内血液雌激素水平呈高度相关。雌激素在乳腺癌发生、发展中的作用及分子生物学机制是近年来研究的热点,对防治乳腺癌及降低其复发率也有着重要的意义。雌激素发挥效应主要是通过经典的雌激素核受体来完成。即通过激活细胞内核受体,影响靶基因的转录和翻译过程,因此又被称为激素的基因组作用(GenomicActions)。ERα和ERβ属于经典的依赖配体激活的核转录因子超家族成员。雌激素与其结合后,通过雌激素反应元件(estrogen reactive element ERE)调节靶基因的转录。同时雌激素还可以与DNA上其他一些转录因子结合,从而募集其他共激活因子。ERα与ERβ因其结构不同,在肿瘤增殖过程中发挥不同的作用。近来研究发现激素还有生长因子样的非核效应,又被称为激素的非基因组作用(Non-Genomic Action)。G蛋白偶联受体-30(G protein-coupled receptor30,GPR30)是一种新型膜受体。研究证实它可与雌激素特异性地结合,快速激活细胞内EGFR-MAPK,ERK,PI3K-AKT等信号通路,参与乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移等行为,并且与乳腺癌的耐药性有关。胞外核苷酸受体称为P2受体,包括P2X和P2Y两个家族。P2Y家族是具有7次跨膜结构的G蛋白耦联受体(含8个亚型),P2X家族则属配体门控非选择性阳离子通道,是2次跨膜受体(含7个亚型)。P2X7受体广泛存在于人体各种组织,并根据组织类型有不同分布,在乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌等肿瘤组织中的表达明显高于对应的正常组织。P2X7受体可诱导表皮细胞分化,引起巨噬细胞融合,刺激细胞因子的表达和释放等,还可通过多条MAPK通路参与细胞的增殖、分化及凋亡。P2X7受体可促进一些肿瘤细胞的增殖分化。其可能的机制为:P2X7受体可以提高细胞内氧化磷酸化效率,增加ATP储量。此外,有研究发现正常甲状腺组织内P2受体激活可导致IL-6释放,而在某些内分泌组织中,IL-6有促细胞增殖与分化作用。本实验室前期研究发现去卵巢大鼠的三叉神经节中P2X3mRNA及蛋白水平均升高,而雌激素替代疗法可降低P2X3基因与蛋白水平的表达。雌激素通过调节初级感觉神经元中P2X3受体,参与外周痛觉转导通路,这种作用可能是通过基因组效应完成的。在直结肠至炎大鼠的背根神经节中,雌激素可上调P2X3mRNA表达。这些均提示雌激素对P2X受体有调控作用。我们之前做了大量的工作,可以初步证明在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中,雌激素可上调P2X7受体的表达进而影响细胞的增殖。为进一步阐明雌激素调控P2X7受体可能的受体机制及信号转导通路,故本实验以雌激素受体ERα(+)、ERβ(+)、GPR30(+)的乳腺癌细胞MCF-7为模型,观察雌激素通过何种受体调节P2X7受体的表达从而影响细胞的增殖活力,以及其中可能的分子生物学机制。为临床工作中雌激素依赖性肿瘤(卵巢癌、子宫内膜癌)的治疗提供新的思路与理论依据。一、实验材料和方法:(一)细胞增殖率的测定采用MTT法测定细胞增殖率。接种于96孔板上的细胞经过药物处理,每孔加15μl MTT继续培养3-4hr,吸去培养基,各孔加入150μl DMSO,置于摇床上低速震荡5min。酶标仪490nm处波长测各孔吸光度。(二)RNA提取和Real-time PCR1、细胞总RNA提取和cDNA合成接种于12孔板中(1×105个/孔)的细胞经药物处理后,以Trizol提取液提取总RNA,采用紫外分光光度法测定RNA样品纯度(OD260/OD280)。同时进行RNA定量测定。提取的RNA中,每样本取2μg在25μl体系中反转录为cDNA,-20°C保存,用于实时定量聚合酶联反应扩增P2X7受体基因。2、Real-time PCR用于扩增P2X7受体的引物对为: Sense,AGATCGTGGAGAATGGAGTG;Antisense,TTCTCGTGGTGTAGTTGTGG。反应条件95C5min,95C30sec,58C25秒,72C30秒,40个循环。用于扩增β-actin的基因引物为Sense, GTGGGGCGCCCCAGGCACCA;Antisense,CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC。反应条件95C5min,95C30sec,55.5C25秒,72C30秒,40个循环。(三)Western Blot种于6孔板的细胞经药物处理后,以预冷的RIPA缓冲液裂解标本,提取样本蛋白。分光光度仪测定蛋白含量,各孔上样量50~80mg蛋白,经10%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳,电转移至硝酸纤维素(NC)膜。封闭,洗涤后分别加1:200稀释的兔抗人抗体P2X7(70kD),1:500稀释的兔抗人抗体ERα(66kD),1:500稀释的鼠抗人抗体ERβ(56kD),1:1000稀释的兔抗人抗体AKT(60kD),1:1000稀释的兔抗人抗体ERK1/2(44/42kD),1:8000稀释的鼠抗人抗体β-actin(42kD),4°C过夜。洗涤后,分别加入1:1000稀释耦联辣根过氧化物酶的羊抗兔抗体和羊抗鼠抗体,室温孵育2hr后采用加强化学发光法(ECL)显色。(四)siRNA(小干扰RNA):根据转染试剂盒说明,用荧光标记的siRNA筛选最佳转染条件和最佳目的siRNA。将含25nmol/L siRNA及转染试剂的无血清培养基混合均匀,转染细胞。分别于18hr、24hr更换新鲜无激素培养基。经不同药物处理细胞后,采用MTT和western blot等方法测定细胞增殖率或目的蛋白表达情况。二、实验结果(一)雌激素通过ERα对乳腺癌MCF-7细胞的促增殖作用1、雌激素及其拮抗剂对MCF-7细胞增殖活力的影响用17β-E2(0.1nmol/L-1μmol/L)处理MCF-7细胞48hr后,细胞的增殖活力均大于对照组的120%(各组P<0.01)。ER拮抗剂ICI182,780可阻断17β-E2对细胞的促增殖作用。2、ERα参与雌激素对MCF-7细胞增殖活力的影响雌激素受体ERα选择性激动剂PPT(0.1nmol/L-10μmol/L)作用MCF-7细胞48hr后,细胞的增殖活力均大于对照组的120%(各组P<0.01)。ICI182,780可阻断PPT对细胞的促增殖作用。共同以17β-E2和ERα拮抗剂MPP作用于细胞96hr后,MPP阻断了17β-E2对细胞的促增殖作用。ERα表达降低也可阻断17β-E2的促细胞增殖效应。3、ERβ不参与雌激素对MCF-7细胞增殖活力的影响ERβ拮抗剂PHTPP不能阻断17β-E2对MCF-7细胞的促增殖效应。ERβ表达降低不能阻断17β-E2对MCF-7细胞增殖活力的促进作用。4、GPR30对MCF-7细胞增殖活力的影响MTT结果显示,雌激素膜受体GPR30选择性激动剂G-1不同浓度(0.1nmol/L-1μmol/L)作用于MCF-7细胞48hr后,细胞增殖活力无明显改变。(二)P2X7受体参与雌激素对乳腺癌MCF-7细胞的促增殖作用1、P2X7受体激动剂或拮抗剂对雌激素促MCF-7细胞增殖的影响MTT结果显示,不同浓度P2X7受体激动剂BzATP(10μmol/L-1mmol/L)作用MCF-7细胞48hr后,细胞增殖活力均明显增加。P2X7受体拮抗剂PPADS既能阻断BzATP对细胞的促增殖效应,也能阻断17β-E2对细胞促增殖效应。2、雌激素受体ERα对P2X7受体表达的影响Western blot结果显示,不同浓度17β-E2(0.1nmol/L-0.1μmol/L)作用MCF-7细胞24hr后,可上调P2X7受体的蛋白表达。实时定量RT-PCR和Western blot结果显示,单独给予17β-E2(0.1μmol/L)处理MCF-7细胞后P2X7mRNA和蛋白表达量均明显增加(P<0.01);ERα拮抗剂MPP(50μmol/L)阻断了17β-E2对P2X7mRNA及蛋白表达的上调作用。单独给予雌激素受体ERα选择性激动剂PPT (0.1μmol/L)处理MCF-7细胞后48hr后P2X7蛋白表达量明显增加(P<0.05);雌激素受体ER拮抗剂ICI182,780能够阻断PPT对P2X7蛋白表达的上调作用。采用ERα siRNA有效降低ERα表达后,给予17β-E2(0.1μmol/L)作用于MCF-7细胞48hr,其P2X7蛋白表达水平与对照组相比无明显与改变(P>0.05)。3、雌激素受体ERβ对P2X7受体表达的影响共同以17β-E2(0.1μmol/L)和PHTPP作用细胞,P2X7mRNA及蛋白表达量较单独给予17β-E2组相比无明显差异(P>0.05)。给予雌激素受体ERβ选择性激动剂DPN(1nmol/L-10μmol/L)作用细胞48hr,P2X7蛋白表达无明显改变。提示雌激素受体ERβ选择性激动剂DPN不能上调MCF-7细胞中P2X7蛋白的表达。4、雌激素受体GPR30对P2X7受体表达的影响给予雌激素受体GPR30选择性激动剂G-1(1μmol/L)与GRP30选择性拮抗剂G-15(1μmol/L)单独或联合作用细胞4hr,P2X7受体蛋白表达无明显改变,提示GPR30不影响P2X7受体蛋白表达。(三)雌激素对MCF-7细胞P2X7受体调节作用的机制研究1、雌激素及ERα对ERK1/2蛋白磷酸化的影响单独给予17β-E(20.1μmol/L)或ERα选择性激动剂PPT(0.1μmol/L)处理MCF-7细胞15min和4hr,其p-ERK1/2蛋白表达量明显升高,提示15min及4hr内17β-E2或PPT均可上调细胞内ERK1/2磷酸化水平。且ICI182,780可阻断17β-E2或PPT对细胞内ERK1/2磷酸化水平的上调作用。2、雌激素及ERα对Akt蛋白磷酸化的影响以同样方法处理细胞,结果提示15min和4hr内17β-E2或PPT均可上调细胞内磷酸化Akt的蛋白含量,且这一作用可被ICI182,780阻断。3、GPR30对ERK1/2及Akt蛋白磷酸化的影响GPR30选择性激动剂G-1(1μmol/L)作用细胞后15min,4hr后,对细胞内ERK1/2蛋白及Akt蛋白磷酸化有明显促进作用。4、雌激素通过ERK1/2通路或AKT通路对P2X7蛋白的影响以U0126或LY294002与雌激素共同作用细胞,与单独给予17β-E2组相比,P2X7蛋白表达明显降低(P<0.05)。提示ERK1/2拮抗剂U0126或Akt拮抗剂LY294002可阻断17β-E2对MCF-7细胞中P2X7的上调作用。三、结论1、雌激素通过激活ERα促进MCF-7细胞的增殖活力。2、雌激素通过ERα上调MCF-7细胞P2X7受体表达,进而促进MCF-7细胞的增殖。3、雌激素可能通过ERK1/2及AKT途径上调P2X7受体的表达。综上所述,雌激素通过作用于雌激素受体ERα上调P2X7受体的表达,发挥促乳腺癌细胞的增殖作用,而这一作用可能与ERK1/2或AKT通路有关。这将为治疗雌激素依赖性乳腺癌细胞提供新的思路。
中文摘要第5-10页
ABSTRACT第10-15页
缩写词汇表第16-18页
前言第18-20页
材料与方法第20-33页
实验结果第33-48页
讨论第48-52页
结论第52-54页
参考文献第54-57页
综述一第57-64页
    参考文献第61-64页
综述二第64-70页
    参考文献第68-70页
在读期间发表文章第70-71页
致谢第71页
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