VEGF受体KDR胞外段1-3区（KDRn3）基因转染抑制脑胶质瘤生长的实验研究

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，具有高发病率、高复发率、高死亡率、低治愈率等特点，严重威胁人类健康，是神经外科治疗中非常棘手的难治性肿瘤之一，目前没有切实有效的胶质瘤的治疗方法，迫切需要寻找新的治疗方法。胶质瘤是典型的血管依赖性实体肿瘤,其生长、发展、浸润、转移与新生血管的形成关系密切，而新生血管形成过程受血管生成调节因子严密调控。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是目前已知作用最强、最特异的血管生成因子，它主要通过血管内皮细胞膜上的受体KDR介导来发挥其促血管生成的作用。研究表明KDR是促进血管内皮细胞有丝分裂、增殖、迁移、分化、微管形成等生命活动的关键介导物，阻断VEGF/KDR途径可以明显的抑制新生血管生成。KDR属于免疫球蛋白超家族，它含有7个细胞外免疫球蛋白样功能区、1个跨膜区和1个细胞内酪氨酸激酶功能区。在KDR的7个细胞外免疫球蛋白样功能区中，domain1-3是与VEGF结合必不可少的区域，KDRn3则为该3个区域的基因序列，它是一种可溶性KDR（sKDR）。本研究首先构建KDRn3腺病毒载体pAd-KDRn3，并观察其在哺乳动物细胞中表达，为研究KDRn3在治疗脑胶质瘤中的作用奠定基础；然后将pAd-KDRn3体外转染大鼠C6胶质瘤细胞，观察目的基因在C6胶质瘤细胞中的表达及其对人脐静脉内皮细胞（ECV-304细胞）增殖的抑制作用，在细胞水平上探讨pAd-KDRn3基因转染抑制新生血管生成的可行性；最后进行pAd-KDRn3治疗脑胶质瘤的动物实验研究，观察KDRn3抗脑胶质瘤血管生成从而抑制脑胶质瘤生长的疗效。本实验的研究工作：1、腺病毒载体pAd-KDRn3的构建与表达目的：利用第二代腺病毒载体构建系统，构建腺病毒载体pAd-KDRn3，观察转染效率及外源基因的表达，为研究KDRn3在治疗脑胶质瘤中的作用奠定基础。方法：以pcDNA3.1/KDRn3为模板，通过PCR扩增KDRn3基因，克隆进T载体；采用腺病毒骨架质粒pAdeasy-1和穿梭质粒pAdTrack-CMV构建重组KDRn3腺病毒载体，酶切鉴定；重组KDRn3基因的腺病毒载体转导293细胞；采用Western Blot方法分析KDRn3的蛋白表达。结果：①序列分析表明，KDRn3基因正确。②KDRn3基因能成功克隆入pAdTrack-CMV，并且在E.Coli5183细胞中同源重组，KDRn3基因插入缺陷型腺病毒基因组。③重组KDRn3基因的腺病毒载体转导293细胞后能产生重组病毒，而且重组病毒可高效转染COS-7细胞。④转染重组病毒的细胞能表达高水平的KDRn3蛋白。结论：成功构建了腺病毒载体pAd-KDRn3，且其成功转染COS-7细胞并能表达高水平的KDRn3。2、pAd-KDRn3体外转染大鼠C6胶质瘤细胞及其对血管内皮细胞增殖的抑制作用。目的：采用腺病毒载体pAd-KDRn3体外转染大鼠C6胶质瘤细胞，观察目的基因在C6胶质瘤细胞中的表达及其对人脐静脉内皮细胞(ECV-304细胞)增殖的抑制作用，在细胞水平上探讨pAd-KDRn3基因转染抑制新生血管生成的可行性。方法：在荧光显微镜下观察EGFP在转染组及对照组内的表达，观察转染组在转染后24小时、48小时、72小时胞浆中发出绿色荧光的细胞数量；用ELISA法检测pAd-KDRn3转染上清中KDRn3的表达水平；用MTT法检测各组对人脐静脉内皮细胞（ECV-304细胞）增殖的抑制作用。结果：①转染组在转染后第24小时细胞胞浆中发出绿色荧光；转染后48小时，胞浆中发出绿色荧光的细胞数量增多；转染后72小时胞浆中发出绿色荧光的细胞达80%以上。对照组细胞内未见绿色荧光。②以不同MOI数值的pAd-KDRn3转染C6胶质瘤细胞后，随着MOI数值的增加，KDRn3的分泌水平随之升高，在转染pAd-KDRn324小时后，KDRn3就显著表达，至72小时达到高峰，此后表达逐渐下降，并持续至96小时以后。③用未转染上清共培养的对照组细胞增殖明显，而用转染上清共培养的各组细胞增殖均受到显著抑制（p＜0.001），随MOI数值的增加，抑制作用明显增强；另外，VEGF存在的实验组与无VEGF的实验组相比，对ECV304的抑制作用显著（p＜0.05）。结论：重组表达载体pAd-KDRn3能有效转染C6胶质瘤细胞并能在C6胶质瘤细胞内高效表达。重组表达载体pAd-KDRn3可显著抑制人脐静脉内皮细胞（ECV-304）的增殖。3、pAd-KDRn3治疗脑胶质瘤的动物实验研究目的：观察KDRn3抑制C6脑胶质瘤血管生成及肿瘤生长的疗效。方法：于大鼠右侧后肢股骨外侧皮下接种对数生长期C6胶质瘤细胞100μl（1×106/100μl/只），观察瘤体形成及生长情况。接种后第7天，选择皮下长出直径约6~9mm肿瘤结节的大鼠18只，共分为3组，每组6只，分别为：①pAd-KDRn3组；②pAdGFP组；③PBS（空白对照）组。测量接种肿瘤细胞28天后肿瘤直径，重量，计算瘤重和体积抑制率。观察C6脑胶质瘤常规病理形态的改变；免疫组化检测肿瘤组织中KDRn3蛋白的表达；观察KDRn3对C6脑胶质瘤的治疗作用；检测肿瘤微血管密度（MVD）。结果：①对照组（pAdGFP组及PBS组）：肿瘤外观呈不规则形，包膜不完整，表面有迂曲血管，质韧，切面实性，中心有大小不等的液化坏死灶，部分见肿瘤表面破溃，部分肿瘤侵及肌肉。常规HE切片见肿瘤细胞大小不一，异型性明显，并见瘤巨细胞。胞核大，呈圆形及不规则形，核浆比例增大，核分裂相多见。免疫组化未能在肿瘤组织中检测到有KDRn3表达。②pAd-KDRn3组：细胞基本形态与对照组相似，有明显的肿瘤坏死灶，坏死灶周围见大量炎性细胞。免疫组化示肿瘤组织中可见棕黄色阳性染色，定位于胞浆。第14天时，pAd-KDRn3组肿瘤体积小于对照组，差异有显著性（P<0.05）；21天与28天时pAd-KDRn3组肿瘤体积明显小于其它二组，差异有显著性（P<0.05）。28天时剥取肿瘤标本测量结果显示，pAd-KDRn3组肿瘤重量均显著小于其它二组，差异有显著性（P<0.05），pAdGFP组及PBS组之间差异无显著性（P>0.05），pAd-KDRn3组肿瘤体积及重量的抑制率分别为59.47%和60.67%。pAd-KDRn3组与对照组比较，MVD明显减少，差异有显著性（P<0.05）。pAdGFP组与PBS组比较无统计学上的差别（P>0.05）。结论：应用KDRn3治疗患胶质瘤病鼠可降低肿瘤的平均瘤重和平均体积，肿瘤内部的MVD明显减少。