信号调节蛋白α负性调节IgE诱导的肥大细胞脱颗粒及细胞因子合成

研究背景及目的近几年随着空气污染等环境变化，过敏性疾病的发病率显著上升，其中包括Ⅰ型超敏反应。Ⅰ型超敏反应发病突然，严重时可能威胁生命。在自然界广泛存在能够致敏的抗原性物质，它们可以经呼吸道消化道或皮肤接触等途径进入体内，刺激免疫系统产生抗原特异性免疫球蛋白E（IgE）。随后IgE分子可以同肥大细胞表面受体FcεRI(high-affinity receptor for the Fc region of immunoglobulin E)稳定结合。FcεRI是一条α链、一条β链和两条相同的γ链组成的四聚体。α链是配体结合链，其胞外区能和IgE的Fc段结合；β链和γ链有ITAM区，发生磷酸化后介导下游信号传递。当特异抗原再次进入体内，可以同IgE分子结合并且使相邻的两个FcεRI交联，引起肥大细胞活化。肥大细胞活化后通过脱颗粒和分泌炎性因子等发挥其生物学作用。体内的免疫反应强度和范围受到多种机制调节，其中包括细胞表面激活性受体和抑制性受体平衡所起到的调控作用。信号调节蛋白家族（signal regulatory proteinfamily）就是一类细胞表面的抑制性受体。信号调节蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）是一种广泛存在的抑制性受体，属于免疫球蛋白受体超家族。SIRPα主要表达在神经元细胞及髓系非淋巴细胞，如肥大细胞。SIRP胞外区具有三个IgSF样结构域和多个糖基化位点，胞内区带有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIMs），其中含四个酪氨酸残基，磷酸化后能够募集含SH2结构域的分子如蛋白磷酸酶SHP-1和SHP-2。肥大细胞作为过敏反应的效应细胞，抑制性受体SIRPα对其功能的调节尚未见系统性报道。我们研究发现抗原活化肥大细胞后SIRPα蛋白表达水平下降，提示SIRPα对肥大细胞活化可能存在抑制作用。为进一步了解SIRPα在肥大细胞活化过程以及Ⅰ型超敏反应中的作用，本课题通过利用差异表达SIRPα的细胞进行研究，研究了SIRPα在抗原诱导肥大细胞活化中的作用。重点是SIRPα对肥大细胞脱颗粒及分泌细胞因子的影响及相关信号通路的调节。实验方法1．建立稳定高表达Myc-SIRPα和转染空载体对照的肥大细胞系。分离培养小鼠骨髓来源肥大细胞(BMMCs)，合成鉴定具有特异干扰效果siRNA，瞬时干扰SIRPα表达，构建BMMCs siSIRPα和BMMCs control细胞；2．采用特异性磷酸化抗体检测SIRPα差异表达的肥大细胞在抗原刺激后p38、JNK、ERK、Akt、NFAT等信号分子的磷酸化水平变化，反映SIRPα对信号通路活化的调节；3．运用荧光素酶报告基因系统检测SIRPα对NF-κB，NFAT转录活性的调节；4．通过检测肥大细胞活化后β-氨基己糖胺酶的释放，研究SIRPα对肥大细胞脱颗粒的调节；5．采用Real-time PCR方法检测肥大细胞炎性因子的mRNA水平；6．采用荧光探针检测SIRPα对细胞骨架F-actin聚合的调节；7．使用Ca2+指示剂检测SIRPα对抗原引起肥大活化过程中Ca2+流动的调节；8．用Western blot检测SIRPα对细胞骨架微管形成的影响；10.将BMMCs siSIRPα及阴性对照细胞输入肥大细胞缺失小鼠（c-kitwsh/wsh）体内，重构肥大细胞系统。进行被动皮肤过敏反应，体内观察SIRPα对肥大细胞功能的调节。11.采用免疫组织沉淀的方法检测SIRPα与SHP-2的结合，SHP-2与PI3Kp85和IKKβ的相互作用。结果1. SIRPα参与抗原诱导的肥大细胞活化过程：在肥大细胞活化过程中，SIRPα蛋白表达降低,并呈现抗原剂量与时间依赖性。同时，SIRPα发生磷酸化并募集SHP-1和SHP-2。2. SIRPα调节肥大细胞活化后分泌功能：SIRPα显著抑制肥大细胞脱颗粒及细胞因子合成。3. SIRPα抑制肥大细胞活化过程中的细胞骨架改变：SIRPα抑制肥大细胞活化过程中α-tubulin聚合及F-actin解聚。4. SIRPα抑制肥大细胞活化过程中的Ca2+释放，提示SIRPα通过调节Ca2+释放影响肥大细胞骨架改变及脱颗粒过程。5. SIRPα对Ⅰ型超敏反应过程中血管渗出的影响：与对照小鼠相比，输入低表达SIRPα肥大细胞的小鼠皮下渗出更加明显。这进一步说明SIRPα抑制肥大细胞分泌功能。6. SIRPα抑制细胞骨架重构的机制：抗原引起肥大细胞活化过程中，SIRPα明显抑制PLCγ1磷酸化，从而抑制Ca2+释放。此外SIRPα明显抑制Rac-1GTPase及PAK1的活性，进而抑制了微管的形成。7. SIRPα影响肥大细胞细胞因子合成分泌的机制：抗原诱导的肥大细胞活化过程中，SIRPα通过抑制MAPK信号通路磷酸化以及转录因子NFκB和NFAT活性，抑制肥大细胞由抗原诱导的炎性因子合成与分泌。8. SIRPα在抗原诱导的肥大细胞活化过程中发挥负性调节作用的机制：肥大细胞活化后，SIRPα通过Src家族激酶发生磷酸化。随后SIRPα通过竞争结合SHP-2，影响SHP-2与PI3Kp85及IKKβ的结合，抑制Akt与NF-κB信号通路。结论本研究从分子－细胞－动物水平较深入研究了信号调节蛋白SIRPα对肥大细胞功能的调节作用，发现SIRPα负性调节肥大细胞活化，包括抑制肥大细胞脱颗粒及炎性因子合成并对体内的过敏反应能力具有负向调控能力。同时本研究进一步探讨了SIRPα调节相关信号转导通路的作用机制，证明SIRPα可能通过抑制SHP-2与IKKβ及PI3Kp85的结合发挥负向调控作用。