柿(Diospyros kaki Thunb.)原产于中国,栽培面积和产量均居世界第一,但传统产区多为涩柿,人工脱涩处理耗费大量人力、物力和财力。柿果呈现涩感是因其果肉中单宁细胞的液胞内含有大量的原花青素(Proanthocyanidins, PAs;也称缩合单宁,condensed tannin)之故。单宁作为类黄酮代谢途径的终产物之一,其生成途径有众多结构基因参与,而结构基因的表达又受转录因子调控。已有研究表明,MYB、basic Helix-Loop-Helix (bHLH)和WD40三类转录因子构成MBW复合体,共同调控单宁的代谢途径。但中国原产完全甜柿自然脱涩是否与上述转录因子有关目前尚不清楚。本研究以中国原产完全甜柿‘罗田甜柿’为主要研究试材,分离克隆了MYB、bHLH和WD40三类转录因子,开展了柿单宁代谢调控相关研究工作。具体研究结果如下。1.发育期柿果实单宁含量测定。在花后5周,供试材料中单位果重内可溶性与不溶性单宁含量均最高,并随果实发育而逐渐减少,到花后13周,‘前川次郎’(日本原产完全甜柿)和‘西村早生’(日本原产不完全甜柿)果实已完成脱涩,而‘罗田甜柿’(中国原产完全甜柿)果实在花后21周后脱涩,‘磨盘柿’(中国原产完全涩柿)不能在树上完成脱涩。‘前川次郎’和‘西村早生’单果的单宁含量在果实发育早期停止增长,而‘罗田甜柿’和‘磨盘柿’的单宁累积持续到果实发育后期。2.‘罗田甜柿’乙醇脱涩处理后单宁含量变化。花后17周,对‘罗田甜柿’进行离体35%乙醇脱涩处理,处理两天后,果实脱涩,可以观察到单宁细胞颜色明显加深,果实中可溶性单宁含量显著减少,同时不溶性单宁含量相应增加,可溶性单宁转变为不溶性单宁,果实通过“凝固效应”而脱涩。3.柿MYB基因克隆及分析。以拟南芥和葡萄MYB转录因子序列为信息探针,在柿EST数据库中进行BLAST分析,找到一个候选片段DC587740,随后在‘罗田甜柿’中扩增出其片段,通过3’RACE和5’Hi-TAIL PCR扩增得到其全长序列1152bp,其中ORF长843bp,编码280个氨基酸,将该基因命名为DkPAl,序列已提交GenBank。DkPA1具有MYB转录因子的典型结构域,属于R2R3类MYB转录因子,通过邻接法构建进化树,发现其与已报道的其他物种中参与单宁调控MYB转录因子具有极高的序列相似性。DkPA1在‘罗田甜柿’与‘磨盘柿’中的表达模式与两个材料中单宁的累积模式一致,与结构基因DkDHD、DkSCPL、DkF3’H、DkF3’5’H、DkANR的表达模式也一致。4.柿bHLH基因克隆及分析。以拟南芥bHLH转录因子AtTT8为信息探针,检索柿EST数据库,找到一个候选片段DC587220,在‘罗田甜柿’中扩增出其片段,通过3’RACE和5’Hi-TAILPCR扩增得到其全长序列2687bp,ORF长2160bp,编码719个氨基酸,将该基因命名为DkMYC1,序列已提交GenBank。DkMYC1且有bHLH家族典型的碱性螺旋-环-螺旋结构,属于bHLH转录因子Ⅲf家族成员,与葡萄和拟南芥中参与单宁代谢调控的bHLH转录因子具有极高的序列相似性。在‘罗田甜柿’、‘前川次郎’和‘磨盘柿’中,DkMYC1的表达模式与三个材料中单宁的累积模式一致,也与DkANR、DkF3’5’H等结构基因的表达模式一致。在‘罗田甜柿’中分离得到单宁代谢途径两个特异基因DkLAR和DkANR启动子序列,发现在DkANR的启动子区具有多个bHLH转录因子的关键调控元件MYCATERD1及MYCCONSENSUSAT,进一步确定其受DkMYC1调控。5.柿WD40基因克隆及分析。通过同源克隆法设计简并引物,在‘罗田甜柿’中扩增出WD40基因片段,通过3’RACE和5’Hi-TAIL PCR扩增到全长序列1640bp,ORF全长1014bp,编码337个氨基酸,将该基因命名为DkWD40,序列已提交GenBank。DkWD40具有4个典型WD40结构域,与葡萄VvWDR1相似性最高。在发育期的果实中,DkWD40的表达与单宁代谢途径中结构基因(DkDHD、DkSCPL、 DkF3’H、DkF3’5’H、DkANR)的表达并不十分相符,而与单宁凝固基因CDkADH1)相符。在乙醇脱涩处理果实中,DkWD40也与单宁凝固基因表达一致。将DkWD40构建超表达载体打入农杆菌,并侵染拟南芥花序,转基因后的拟南芥种皮颜色为黑褐色。6.组织特异性表达分析。DkPA1、DkMYC1和DkWD40在四种供试材料茎、叶、花、萼片、果皮、果肉和种子中均有表达,并非果实特异表达基因,在不同品种的不同部位,其丰度不同,在完全涩柿中表达量高于完全甜柿,且在幼嫩的叶和萼片中表达量较高,在果实中的表达量高低与果实中单宁含量成正相关。7.‘华柿1号’种质鉴定。通过测定‘华柿1号’果实单宁含量及单宁细胞大小,观察与统计果实及种子情况,结合RAPD和ISSR等多种分子标记鉴定结果,推测‘华柿1号’是一个起源于日本的不完全涩柿种质,其在柿的遗传改良中可能具有重要价值。本研究从中国原产完全甜柿‘罗田甜柿’中分离到MYB转录因子基因DkPAl, bHLH转录因子基因DkMYCl以及WD40转录因子基因DkWD40,通过在不同脱涩类型的柿品种果实发育期自然脱涩过程及乙醇脱涩处理前后果实中进行实时定量表达分析,结合单宁含量测定及单宁代谢结构基因表达情况,推测DkPAl和DkMYCl直接参与柿果实发育期单宁代谢调控,而DkWD40参与可溶性单宁向不溶性单宁转化的脱涩过程。
