TLR4在破骨细胞中的生物学作用及其与经典Wnt信号相互作用机制的初步研究

骨骼作为人体重要器官发挥着不可或缺的作用，与此同时骨疾病也成为人类面临的重大疾病之一，近年来细菌感染导致的炎症性骨疾病发生率逐渐增长，但是其治疗仍然是难点。口腔中常见的炎症性骨疾病主要有慢性牙周炎和慢性根尖周炎，细菌是引起慢性根尖周炎和牙周炎的重要物质，其中革兰氏阴性菌占有主导地位，它可以产生脂多糖，脂多糖作为影响牙槽骨骨代谢的重要物质，能造成牙槽骨的炎症与吸收，最终导致牙齿丧失。正常的骨改建主要依赖成骨细胞和破骨细胞的相互交替作用而完成，炎症时成骨细胞和破骨细胞在这一过程中的相互协调作用会被扰乱，从而发生骨的代谢异常。目前研究报道TLR4可能参与了LPS引起的炎症反应，诱导相关炎症因子的表达主要包括细胞因子和趋化因子，最终导致炎症反应发生。经典Wnt信号通路不仅能调控成骨细胞、破骨细胞的增殖、分化和凋亡等，而且还在炎症性骨疾病如慢性牙周炎和类风湿性关节炎中发挥着重要作用。最新研究报道，TLR4在新生小鼠回肠上皮中可以下调Wnt信号，然而关于TLR4与经典Wnt信号在破骨细胞中相互作用机制的研究尚未见报道。既然TLR4与经典Wnt信号通路在骨疾病都起到了如此重要的作用，我们便猜想这两者在骨代谢过程中是否也会相互作用而影响骨组织的吸收和形成呢？本研究首先将LPS作为模拟成骨细胞和破骨细胞的炎症微环境的介质，然后利用LPS激活破骨细胞体内的TLR4，进而采用细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR、Western blot、细胞迁移等技术检测TLR4在破骨细胞中的表达和作用，同时也研究了经典Wnt信号通路在破骨细胞中的主要作用，以期进一步探讨TLR4与经典Wnt信号通路在破骨细胞中的相互作用机制。研究内容分为三部分：1、 LPS体外模拟大鼠成骨细胞、破骨细胞的炎症微环境目的：将LPS作为模拟成骨细胞和破骨细胞炎症微环境的主要介质，检测炎症时成骨细胞和破骨细胞主要生物学特性的改变。方法：分别配置含不同浓度（0、10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml）LPS的DMEM培养液，分别刺激成骨细胞、破骨细胞一定时间，利用MTT、碱性磷酸酶ALP染色、TRAP染色、ALP含量测定、RT-PCR等方法分别检测LPS刺激细胞后其主要生物学特性的改变。结果：（1）不同浓度LPS对成骨细胞的增殖和分化能力均有抑制作用，且都有浓度依赖性。10ug/ml LPS作用于成骨细胞24h后，其主要成骨相关标志酶ALP、Runx2mRNA表达水平均较对照组明显降低（P<0.05）。（2）不同浓度LPS均可促进破骨细胞增殖和分化能力，且能增高破骨细胞破骨相关标志酶TRAP、MMP-9、CathinK mRNA的表达水平（P<0.05）。结论：LPS模拟成骨细胞和破骨细胞炎症微环境时，可能造成成骨细胞的活性降低，而破骨细胞的活性增高。2、 TLR4在炎性破骨细胞中的表达及其生物学效应目的：检测TLR4在破骨细胞中的表达变化及炎症时对破骨细胞迁移率和细胞内破骨相关酶mRNA表达水平的作用。方法：将实验分为2组：（1）对照组：正常DMEM培养液（2）含10ug/ml LPS的DMEM培养液，两组分别刺激细胞24h，利用PCR、Western、实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光技术、细胞迁移等方法检测TLR4在破骨细胞中的表达变化及炎症时其对破骨细胞迁移率和破骨活性相关酶的作用。结果：（1）TLR4在正常破骨细胞中是可以表达的，且较对照组相比，LPS能激活其mRNA、蛋白水平及荧光强度在破骨细胞中的表达（P<0.05）。（2）TLR4被LPS激活后可作用于破骨细胞而增高细胞破骨相关酶的活性及细胞迁移率（P<0.05）。结论：破骨细胞内TLR4被LPS激活后可能通过激活其下游某通路而导致破骨细胞活性增强。3、经典Wnt信号在炎性破骨细胞中的主要作用及其与TLR4的相互作用机制研究目的：Wnt信号通路对炎性破骨细胞内相关标志酶的主要作用及其与TLR4在破骨细胞中的相互作用进行研究。方法：实验随机分为6组：空白对照组（正常培养液）、LPS组（10ug/ml）、Wnt3a组（100ng/ml）、DKK1组（200ng/ml）、LPS+DKK1组、LPS+Wnt3a组，分别与破骨细胞共同培养24h后；利用RT-PCR分别检测破骨细胞中破骨相关酶酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、组织蛋白酶K(cathin K)、TLR4以及经典Wnt信号通路中主要信号分子β-catenin、LRP-6mRNA表达水平。同时利用细胞免疫荧光技术检测LPS激活TLR4后细胞内β-catenin荧光强度的变化。结果：（1）外源性Wnt3a、DKK1作用于破骨细胞后，Wnt3a能下调细胞内破骨相关标志酶mRNA的表达水平、DKK1则上调其mRNA的表达水平（P<0.05）；但两者对TLR4mRNA的表达水平均无明显作用（P>0.05）。（2）LPS可激活破骨细胞中TLR4的表达，其被激活后使破骨细胞内各破骨相关酶mRNA的表达水平上调（P<0.05）；同时LPS激活TLR4后可下调Wnt信号分子β-catenin、LRP-6mRNA的表达水平和β-catenin的荧光表达强度（P<0.05）。（3）将Wnt3a、DKK1、LPS+Wnt3a、LPS+DKK1分别作用破骨细胞24h后，与LPS单独刺激相比，LPS联合Wnt3a作用后使其对细胞内相关酶表达的上调作用明显降低（P<0.05）；相反地，LPS联合DKK1作用后也使其对细胞内相关酶表达的上调作用进一步增强（P<0.05）。结论：TLR4可能通过抑制经典Wnt信号而促进破骨细胞的活性；同样，经典Wnt信号也可能拮抗LPS参与的炎症反应过程中TLR4对破骨细胞相关酶的激活作用。