背景：流行病学调查研究的结果表明随着人们生活节奏和工作强度的增加,腰痛发病率有增加趋势。腰部是我们人体中发力和运动最多的部位,承上启下,保护腹部内脏及脊柱,为人体脊柱周肌肉提供支持,也是最容易损伤的部位。在门诊接触的病人中有60%患有不同程度的腰痛。引起腰痛的病因有10余种,如劳损性病变：腰肌劳损,退行性病变：腰椎间盘突出(LDH)、椎管狭窄及骨质增生,肿瘤性病变：腰椎肿瘤及椎管肿瘤,免疫性病变：强直性脊柱炎,外伤性病变：腰部骨折、软组织伤等。而在如此诸多腰痛原因中,以椎间盘源性腰痛(DLBP)最为特殊。因DLBP其复杂的病因学、不明的发病机理和缺乏有效的临床治疗手段,是目前现代骨科病研究领域中的热点。电生理研究表明,在正常生理条件下,神经纤维只存在于椎间盘最外层的纤维环中,而DLBP的病人神经纤维分布于髓核和内层纤维环中。此迹象表明神经纤维的向内生长是DLBP病人发病的重要机制之一。神经生长因子(NGF)的过度表达和炎症因子如白细胞介素-1β(IL—1β)、白细胞介素-6(IL—6)等的过度分泌是DLBP病人发病机制的关键。许多人认为NGF表达异常是在DLBP病人中神经长入的主要诱导因素,而且其炎症性疼痛信号也主要是通过NGF依赖神经元介导。在DLBP病人中,NGF不仅可以诱导神经的长入,还参与炎性痛敏。因此,我们推测IL—1β和IL—6引起的NGF异常表达在DLBP中起到重要作用。基于以上的猜测,我们设定此实验以观察小干扰核糖核酸(siRNA)是否能在炎性因子IL—6和IL—1β存在下对NGF的起干扰作用。目的：通过研究siRNA对在IL—6和IL—1β作用下的NGF是否有干扰作用,以来指导临床上对DLBP的治疗。方法：60只无特异病原体的斯普拉格-杜勒鼠(SD),一半雄性,一半雌性,重约180—240克之间,平均223±12.4克,2.5—3.5个月,平均2.94±0.73个月。(由山东大学医学院动物中心提供,中国注册号SYXK(鲁)2007-0081。)将髓核和纤维环细胞从SD大鼠椎间盘中分离出来,标本取出后立即用冷PBS液冲洗三次,髓核组织切割成片状放入DMEM/F12培养剂中,然后4℃、4000r/min离心,再悬浮后在37℃含5%CO2条件下孵育8小时。在4℃、4000r/min离心后,移除上清液,细胞用PBS洗涤,用0.25%胰蛋白酶和2%1I型胶原酶消化。再一个4℃、4000r/min离心后,除去上清液,细胞再悬浮于在DMEM/F12培养基,然后将再悬浮的细胞进行计数,以确定细胞达104／L。随后的细胞在1×104／L被转移到37℃含5%的CO2培养箱中培养。在细胞培养7天后,细胞被转移到无血清培养基中再培养24小时。将细胞分为对照组和实验组,培养于含0.3%胎牛血清的DMEM/F12中培养,实验组加入10nmol/L,20nmol/L,50nmol/L,100nmol/L的IL-1和IL-6p培养48小时。在对数生长期的细胞达2.5×105/ml的密度后接种于六孔培养板上。按试剂盒的要求,将二乙基焦磷酰胺水和阳离子脂质体(TM2000)进行稀释,然后和神经生长因子siRNA混合,加入培养板(2.5×105/孔)在37℃、5%CO2培养箱混合物孵育10分钟。培养基更换及时,用流式细胞仪评估细胞的转化率。反转录和RT-PCR扩增通过PCR仪自动完成,使用传统系统配对。反应条件：逆转录：7℃15分钟,85℃5秒；扩增：93℃2分钟；93℃15秒,55℃25秒,72℃25秒,共40个周期；72℃10分钟。Ct值(cDNA拷贝数/u1)是指当荧光信号的周期数达到设定阈值时,每个培养板的Ct值与初始的拷贝数的对数线性关系,即较高的初始拷贝数对应较小的Ct值。对于不同样品中的总RNA浓度差异,NGF mRNA的表达是根据以下公式计算：Ct目标基因/Ct参照基因。收集细胞培养基100μL,并严格按照ELISA试剂盒说明书测定NGF水平。在这前后分别用RTQ-PCR监测神经生长因子mRNA的表达,用ELISA法监测神经生长因子的浓度。数据均用SPSS17.0软件分析。NGF mRNA表达与NGF水平呈正态分布,表示为平均值±标准差。NGF siRNA导入前后的比较采用配对t检验差异。多组比较采用单向方差分析进行。标准是α＝0.05。结果：经过一系列的培养和操作后,细胞在体外培养成功,通过染色及显微镜观察,我们获得了髓核细胞和纤维环细胞。流式细胞检测仪显示神经生长因子siRNA细胞导入率达99.8%,达到了实验要求的导入率。不同浓度的标准曲线放大后显示出良好的并行性和光滑曲线,表明扩增条件为特异性高的准确性,实验误差在理想的范围内。与阴性对照组相比,NGF在siRNA干扰之前,在10nmol/L,20nmol/L,50nmol/L,100nmol/L的IL-1和IL-6p液中,mRNA的表达分别增加了3.4,3.7,4.7,8倍。而在siRNA干扰后,每一组NGF mRNA的表达较干扰前降低了39.5%,45.5%,45.3%,47.8%(P<0.05)。在siRNA干扰前,在10nmol/L,20nmol/L,50nmol/L,100nmol/L组的IL-1和IL-6β液中,NGF水平与对照组相比分别提高2.9,3.3,4.5,7.4倍；siRNA干扰后,每一组中NGF水平与干扰前相比下降了33.8%,35.4%,43%,54.9%(P<0.05)。NGF含量和mRNA的表达水平在进行神经生长因子siRNA干扰后均显著减少。结论：在椎间盘细胞中,siRNA可抑制NGF对炎性细胞因子IL-1和IL-6β刺激作用的反应,这可为治疗DLBP提供新的治疗方法。同时炎症因子IL-6、IL-1β可以刺激体外培养模型椎间盘细胞NGF的分泌,且其效率具有浓度依赖性。意义：我们探索从分子生物学的角度将有干扰作用的siRNA导入DLBP病人的椎间盘内,抑制NGF对IL-6和IL-1刺激的反应,进而抑制神经纤维的长入,从神经方面截断痛觉向大脑的传导,成为一种新的方法来治疗DLBP。这是我们此次研究的贡献所在。创新：虽然我们使用传统的方法分离和培养细胞、作相应的结果检测,但我们的创新点是分别有4个浓度组。虽然增加了实验难度,但更接近疾病由轻到重的发展规律。通过不同的浓度组,能更好地观察在系列条件下相应指标的变化情况,寻找变化趋势及规律。探索从分子生物学的角度来治疗DLBP。不足：然而,这项研究的局限在于体外培养大鼠椎间盘细胞的使用,而对人体内部是否有作用,还需进一步研究,同时将siRNA导入人体椎间盘内的临床可行性和伦理性尚需确定。DLBP的确切发病机制是非常复杂的,大多数受影响的患者遭受着长期的慢性损害。椎间盘炎模型的建立需要进一步的改进。另一方面,本研究只证实了NGF siRNA在治疗DLBP中体外的适用性,更多的调查研究需要在体内进行试验。
