用于细胞内氧化还原状态可逆检测的近红外荧光探针的设计合成及生物应用

细胞内氧化还原状态的平衡,对维持生物体细胞内的正常生理功能是极为重要的。细胞内的氧化还原状态平衡是通过控制细胞内还原性物质和活性氧的量，使这二者之间达到相对平衡来实现的。生物体内最重要的还原性物质是硫醇类物质。硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞内的抗氧化系统中起着重要的作用。大量研究表明，生物体内的很多疾病的产生，严重依赖于这些硫醇类物质在生物体内的含量水平。对于活性氧（ROS）而言，一方面在细胞内信号转导等方面起着重要作用。另一方面活性氧若在体内过度产生，将会导致“氧化应激”,进而对细胞产生氧化损伤，与许多疾病也有着紧密的联系。因此，细胞氧化还原状态的动态变化可以为临床医学等领域提供丰富的生理、病理信息。荧光分析方法因其具有直观、简便、原位、信息丰富等特点，尤其与现代成像技术相结合已被广泛应用于生命分析领域，由此开发新的可以瞬时、动态可逆检测细胞内氧化还原状态变化的荧光探针，具有十分重要的意义。本文基于硫醇类化合物能特异性打断ebselen分子中的Se-N，导致ebselen分子中的五元环开环，之后通过H2O2的氧化作用五元环结构恢复，我们设计了一个能特异检测GSH/H2O2的近红外有机硒荧光探针。本文主要开展了以下两方面的研究工作：(一)我们以近红外花菁染料作为荧光母体，利用硒氮键与硫醇中巯基的特异性反应，以及ebselen五元环中的开关环反应的化学特性来设计了可逆荧光探针Cy-O-ebselen，该探针实现了化学体系和生理条件下对GSH和H2O2的可逆荧光应答，并且对GSH具有较高的选择性和灵敏度。并利用激光共聚焦荧光显微镜，成功实现了细胞内多个氧化还原循环的荧光成像，实验表明该探针可以很好地可逆检测活细胞内GSH的浓度变化，并且具有良好的膜透性和较低的生物毒性。此外，该探针的发射波长位于较长的近红外区域，可以有效地避免生物样品中自发背景荧光的干扰。因此，这种探针对细胞内氧化还原调控的生理功能、信号转导等领域的研究提供了新的研究途径和方法。（二）利用我们的近红外可逆荧光探针Cy-O-ebselen，检测HepG2细胞内氧化还原状态的变化对HepG2细胞凋亡过程的影响。并用Western-blot、细胞核染色、线粒体膜电位等方法监测了在这一凋亡过程中的信号指标。实验结果表明HepG2细胞内氧化还原状态的变化确实能够引起细胞的凋亡，并且我们的探针能够对这一过程进行可视化的监测。另外，我们用探针分别实时监测了肝癌细胞和肝细胞在由氧化还原环境的改变引起的凋亡的可逆性，实验发现在肝癌细胞中凋亡可以发生逆转，而正常的肝细胞则没有这种现象。总之，由GSH的含量水平引起的氧化还原状态的改变，在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，并且我们的探针可以为进一步研究氧化还原状态的改变在细胞凋亡、信号转导所起的作用提供新的工具。