糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病常见和严重的眼部并发症,是不可逆性盲的重要原因。随着人们生活方式的改变,人均寿命的延长,DR发病率呈上升趋势,患者因视网膜微血管病变和神经组织病变导致视力损害,严重影响生活质量。因此,DR的防治成为糖尿病及其并发症研究领域的重要课题。中药复方具有多靶位、多途径的治疗效应,可充分发挥中医整体调节的优势。菩人丹超微粉(Purendan superfine powder, PRD)是针对糖尿病病机关键“热、虚、瘀”的中药复方,具有益气养阴清热、活血化瘀通络之功效。本研究采用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)建立糖尿病大鼠模型,探讨PRD对糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用,为中药复方治疗DR提供实验基础和理论依据。第一部分菩人丹超微粉对糖尿病大鼠视网膜VEGF和PEDF表达的影响目的：观察PRD对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)表达的影响,探讨PRD对糖尿病大鼠视网膜微血管病变的保护作用。方法：1清洁级雄性Wistar大鼠36只,随机分为3组：正常对照组、糖尿病模型组和PRD治疗组。正常对照组大鼠不做任何处理；糖尿病模型组、PRD治疗组大鼠均建立STZ致糖尿病大鼠模型,以血糖(blood glucose, BG)≥16.7mmol/L作为成模标准。模型成功建立后,糖尿病模型组大鼠不再做任何处理；PRD治疗组大鼠给予PRD (1.8g/kg/d)灌胃3个月。2采用ONE TOUCH血糖仪检测各组大鼠的BG。3采用苏木素-伊红(HE)染色观察各组大鼠视网膜组织病理学变化。4分别采用SP免疫组织化学染色法、Westen blotting法检测各组大鼠视网膜VEGF和PEDF蛋白的表达。5采用RT-PCR法检测各组大鼠视网膜VEGF和PEDF mRNA的表达。结果：1各组大鼠的BG：糖尿病模型组大鼠的BG为(21.63±1.01)mmol/L,明显高于正常对照组大鼠(P<0.01); PRD治疗组大鼠的BG为(14.60±0.95) mmol/L,明显低于糖尿病模型组大鼠(P<0.01)。2各组大鼠视网膜组织病理学改变：正常组大鼠视网膜各层结构完整,层次清晰,内界膜表面光滑；各级神经细胞大小均匀,排列有序。模型组可见视网膜内界膜明显肿胀、增厚、表面粗糙不平,部分内界膜破裂,偶见毛细血管内皮细胞突出于内界膜,视网膜分层欠清晰,神经节细胞排列紊乱、稀疏,细胞数量减少,细胞空泡样变、核固缩,部分核溶解。PRD组视网膜内界膜轻度肿胀、增厚、表面粗糙欠平,视网膜分层清晰,神经节细胞排列轻度紊乱,数量轻度减少。3各组大鼠视网膜VEGF的表达：VEGF蛋白免疫阳性产物位于细胞浆,呈棕黄色颗粒状。免疫阳性细胞主要分布于视网膜神经节细胞层及内核层。糖尿病模型组与正常对照组比较,大鼠视网膜VEGF蛋白及mRNA的表达均明显升高(P<0.01); PRD治疗组与模型组比较,大鼠视网膜VEGF蛋白及mRNA的表达均明显降低(P<0.01)。4各组大鼠视网膜PEDF的表达：PEDF蛋白免疫阳性产物位于细胞浆,呈棕黄色颗粒状。免疫阳性细胞主要分布于视网膜神经节细胞层及内核层。糖尿病模型组与正常对照组比较,大鼠视网膜PEDF蛋白及mRNA的表达均明显降低(P<0.01)；PRD治疗组与模型组比较,大鼠视网膜VEGF蛋白及mRNA的表达均明显升高(P<0.01)。结论：PRD可通过上调糖尿病大鼠视网膜PEDF表达,下调VEGF表达,减少视网膜血管渗漏和抑制病理性新生血管形成,发挥对糖尿病视网膜微血管病变的保护作用。第二部分菩人丹超微粉对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡及相关基因表达的影响目的：通过观察PRD对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡及相关基因表达的影响,探讨PRD对糖尿病视网膜神经组织损伤的保护作用。方法：1清洁级雄性Wistar大鼠36只,随机分为3组：正常对照组、糖尿病模型组和PRD治疗组。正常对照组大鼠不做任何处理；糖尿病模型组、PRD治疗组大鼠均建立STZ (25mg/kg,连续3d)致糖尿病大鼠模型,以BG≥16.7mmol/L作为成模标准。待模型成功建立后,糖尿病模型组大鼠不再做任何处理；PRD治疗组大鼠给予PRD (1.8g/kg/d)灌胃3个月。2采用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠视网膜神经细胞凋亡。3分别采用SP免疫组织化学染色法、Western Blotting法检测各组大鼠视网膜B细胞白血病/淋巴瘤相关抗原2(B-cell leukemia/lymphoma2, bcl-2)、B细胞白血病/淋巴瘤相关抗原相关X蛋白(Bcl-associated X, bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白的表达。4采用RT-PCR法检测大鼠视网膜bcl-2、bax和caspase-3mRNA的表达。结果：1各组大鼠视网膜神经细胞凋亡：各组大鼠视网膜切片均可见TUNEL阳性染色。TUNEL阳性产物位于胞核,呈棕黄色颗粒状,阳性细胞主要分布于视网膜神经节细胞层及内核层,呈散在分布。模型组大鼠视网膜神经细胞凋亡指数(Apoptosis Index, AI)较正常组明显升高(P<0.01); PRD治疗组大鼠视网膜神经细胞AI较模型组明显降低(P<0.01)。2各组大鼠视网膜bcl-2和bax的表达：bcl-2和bax蛋白免疫阳性产物均位于细胞浆,呈棕黄色颗粒状,bcl-2和bax免疫阳性细胞主要分布于视网膜神经节细胞层及内核层。糖尿病模型组与正常对照组比较,大鼠视网膜bcl-2蛋白及mRNA的表达、bcl-2/bax比值均明显降低(P<0.01),bax蛋白及mRNA的表达均明显升高(P<0.01); PRD治疗组与模型组比较,大鼠视网膜bcl-2蛋白及mRNA的表达、bcl-2/bax比值均明显升高(P<0.01),bax蛋白及mRNA的表达均明显降低(P<0.01)。3各组大鼠视网膜caspase-3的表达:caspase-3蛋白免疫阳性产物位于细胞核,呈棕黄色颗粒状。免疫阳性细胞主要分布于视网膜神经节细胞层及内核层。糖尿病模型组与正常对照组比较,大鼠视网膜caspase-3蛋白及mRNA的表达均明显升高(P<0.01); PRD治疗组与模型组比较,大鼠视网膜caspase-3蛋白及mRNA的表达均明显降低(P<0.01)。结论：1糖尿病大鼠视网膜存在神经细胞凋亡及相关基因表达的异常,表现为视网膜神经细胞AI升高,bcl-2表达降低、bax和caspase-3表达升高。2PRD可通过上调bcl-2的表达、下调bax和caspase-3的表达,减少糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡,发挥对糖尿病视网膜神经组织损伤的保护作用。
