土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因的克隆和磷酸丙糖异构酶基因的克隆及表达

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东毕吸虫病是由分体科东毕属的各种吸虫寄生于牛、羊等哺乳动物的门静脉和肠系膜静脉而引起的一种血吸虫病。该病在我国分布极其广泛,给畜牧业带来极大经济损失。同时东毕吸虫的尾蚴可使人患尾蚴性皮炎,也称稻田皮炎,严重影响人类的身体健康,是一种非常重要的人畜共患寄生虫病。 目前对东毕吸虫病的防制还存在诸多困难,首先,实践证明通过杀灭血吸虫的中间宿主——螺类来防治血吸虫感染的效果是不明显的;其次,通过吡喹酮治疗血吸虫病虽然效果很好,但也存在治疗费用高、不能防止重复感染以及耐药性的产生等缺点,现普遍认为有必要研究血吸虫的疫苗来预防此病。本研究克隆了土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因(ACTIN)和磷酸丙糖异构酶基因(TPI)的全长序列,并将磷酸丙糖异构酶基因在毕赤酵母中高效表达。 首先,根据日本血吸虫和曼氏血吸虫肌动蛋白基因和磷酸丙糖异构酶基因核苷酸序列的保守区设计引物,利用RT-PCR从土耳其斯坦东毕吸虫成虫总RNA分别扩增ACTIN和TPI的中间大片段,再根据已知序列利用5RACE和3RACE技术分别扩增出ACTIN和TPI的5’和3’端,将三段序列拼接得到ACTIN和TPI的全长cDNA序列并登录GeneBank,登录号为:ACTIN为DQ017265,TPI为DQ092331。 其次,根据TPI全长cDNA序列设计两条加有EcoR I和Not I酶切位点的引物,利用RT-PCR扩增TPI全长序列并克隆到pMD18-T载体,EcoR I和Not I双酶切重组载体pMD18-T/TPI后将获得的全长TPI亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k构成重组表达载体pPIC9k/TPI,Sal I酶切重组表达载体pPIC9k/TPI后电击转化到酵母菌株GS115感受态细胞中,用组氨酸缺陷培养基和G418依次筛选多拷贝质粒整合的毕赤酵母菌株。重组酵母细胞在含甲醇的培养基中分泌表达目的蛋白,培养3d后收取上清,SDS-PAGE显示表达的蛋白分子量为43kDa,进行westernblot分析结果表明该蛋白被自然感染东毕吸虫的绵羊血清所识别。蛋白表达时相分析表明,甲醇诱导72h蛋白表达产量最高。表达产物通过葡聚糖凝胶G-75层析柱纯化,测定蛋白浓度为1200mg/L。 最后,用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,ELISA分析结果表明:空白组的抗体水平一直处于平稳的状态,而免疫组在免疫后抗体水平呈现不断上升的趋势,一次免疫组和加强免疫组的抗体水平均在第四周达到峰值,但加强免疫组较一次免疫组的免疫效果好。由此可见,TPI蛋白具有一定的免疫原性,可以作为东毕吸虫疫苗的候选基因。
目录第3-5页
摘要第5-6页
Abstract第6页
缩略语表第7-8页
1.前言第8-18页
    1.1 文献综述第8-17页
        1.1.1 东毕吸虫病研究进展第8-15页
        1.1.2 血吸虫肌动蛋白研究进展第15-17页
        1.1.3 血吸虫磷酸丙糖异构酶研究进展第17页
    1.2 研究的目的和意义第17-18页
2.材料和方法第18-39页
    2.1 材料与试剂第18-25页
        2.1.1 主要仪器第18-19页
        2.1.2 试验材料第19页
        2.1.3 主要试剂及试剂盒第19-20页
        2.1.4 主要试剂及配制第20-25页
    2.2 技术路线图第25页
    2.3 肌动蛋白基因和磷酸丙糖异构酶基因全长序列的克隆第25-32页
        2.3.1 肌动蛋白基因和磷酸丙糖异构酶基因中间大片段的克隆第25-28页
        2.3.2 肌动蛋白基因5’端和磷酸丙糖异构酶基因5’端的克隆第28-30页
        2.3.3 肌动蛋白基因3’端和磷酸丙糖异构酶基因3’端的克隆第30-32页
        2.3.4 肌动蛋白基因和磷酸丙糖异构酶基因全长序列的拼接第32页
    2.4 磷酸丙糖异构酶基因在毕赤酵母中的表达第32-37页
        2.4.1 磷酸丙糖异构酶全长基因的克隆第32-33页
        2.4.2 重组表达载体的构建第33页
        2.4.3 重组质粒的转化和筛选第33-35页
        2.4.4 蛋白诱导表达第35页
        2.4.5 表达产物的生物特性鉴定第35-37页
    2.5 表达产物的纯化及蛋白浓度的检测第37页
        2.5.1 表达产物的纯化第37页
        2.5.2 蛋白浓度的检测第37页
    2.6 免疫效果分析第37-39页
        2.6.1 免疫程序第37-38页
        2.6.2 酶联免疫吸附试验第38-39页
3.结果与分析第39-49页
    3.1 肌动蛋白基因和磷酸丙糖异构酶基因全长序列的克隆第39-45页
        3.1.1 肌动蛋白基因和磷酸丙糖异构酶基因中间大片段的克隆第39-40页
        3.1.2 肌动蛋白基因5’端和磷酸丙糖异构酶基因5’端的克隆第40-41页
        3.1.3.肌动蛋白基因3’端和磷酸丙糖异构酶基因3’端的克隆第41-43页
        3.1.4 肌动蛋白基因和磷酸丙糖异构酶基因全长序列的拼接第43-45页
    3.2.磷酸丙糖异构酶基因在毕赤酵母中的表达第45-47页
        3.2.1 磷酸丙糖异构酶全长基因的克隆第45页
        3.2.2 重组表达载体的构建、转化及筛选第45页
        3.2.3 蛋白诱导表达第45-46页
        3.2.4 表达产物的生物特性鉴定第46-47页
    3.3 表达产物的纯化及蛋白浓度的检测第47页
    3.4 免疫效果分析第47-49页
        3.4.1 酶联免疫吸附试验第47-49页
4.讨论第49-53页
    4.1 RNA质量对RACE的影响第49页
    4.2 TPI蛋白在毕赤酵母中表达的研究第49-52页
        4.2.1 毕赤酵母表达系统第49-51页
        4.2.2 TPI蛋白在毕赤酵母中表达第51-52页
    4.3 纯化TPI蛋白的免疫和抗体消长水平的检测第52-53页
结论第53-54页
参考文献第54-58页
致谢第58-59页
附录第59-60页
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