恶性黑素瘤是一种恶性程度高、进展快、易转移复发、预后差的皮肤科恶性肿瘤,近年来其发病率不断增加[1]。恶性黑素瘤发生发展机制复杂,在信号转导的不同层次受多个分子的调控。迄今为止,国内外学者已发现众多分子参与恶性黑素瘤的发生,如目前已经确认,细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A(cyclin-dependent kinase inhibitor2A, CDKI2A)和细胞周期素依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)为皮肤恶性黑素瘤的两个高风险性易感基因,而p14ARF基因和细胞周期素D1基因也可能是恶性黑素瘤易感基因,黑皮质素受体-1则被确认为恶性黑素瘤的低风险性易感基因。但这些分子尚不能完全解释恶性黑素瘤发生发展的本质,提示存在着未知的分子机制,传统的针对单个分子的研究与干预难以满足需要,因此,采用新思路、新方法进一步探索并阐明恶性黑素瘤发生发展机制具有非常重要的意义。转录因子是一类在细胞生理过程中发挥重要调控作用的分子。研究表明,人类基因的数量远远大于转录因子的数量,这说明一个转录因子“一对多”地调控下游基因的表达,一个基因也受到多个转录因子的调控,从而形成复杂的调控网络。转录因子通过转录激活或转录抑制在基因表达调控中扮演了极其重要的角色,是细胞内重要的基因表达调控蛋白,与细胞分化、凋亡、癌变等多种生物现象密切相关。已有文献报道NF-KB(Nuclear transcription factor-κKB, NF-κB)[6-8]和激活蛋白(Activactor Protein,AP-1)等转录因子参与了恶性黑素瘤的发生和发展。因此,转录因子活性的检测对探究恶性黑素瘤发生发展机制非常有意义,转录因子有可能成为预测恶性黑素瘤进展的有效标志。转录因子CUTL1(又称CDP, CCAAT置换蛋白)属于同源结构域转录因子CDP家族,其在进化上高度保守。CUTL1定位于7q22,包含四个DNA结合结构域,其中三个为Cut重复序列(CR1、CR2和CR3),一个为Cut同源结构域。CUTL1基因全长为340kb,包含33个外显子,2个启动子区域,2个多腺苷酸化位点和7种选择性剪切位点。由于选择性转录起始、剪切和多腺苷酸化而产生了5种不同转录本。CUTL1在细胞分化、细胞增殖、细胞周期进展中发挥重要作用,参与了乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等恶性肿瘤发生发展。并有文献报道Wnt5A等多个基因受CUTL1调控,是CUTL1的靶标,而Wnt5A是恶性黑素瘤发生发展中的重要分子,那么是否可以推测CUTL1也参与了恶性黑素瘤发生发展呢?其发挥作用的机制又是什么呢?这些问题尚无确切证据可以回答。本研究拟检测CUTL1在恶性黑素瘤组织和细胞中的表达,并从多水平、多层次验证CUTL对恶性黑素瘤增殖能力的影响,从而证实CUTL1在恶性黑素瘤发生发展中的作用,并初步探讨CUTL1参与黑素瘤发生发展的可能机制,为临床上早期诊断恶性黑素瘤,并有效控制其恶性进展,提供重要理论根据和坚实的实验基础。[研究目的]1.检测转录因子CUTL1在恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达及意义。2.观察CUTL1对恶性黑素瘤细胞生物学行为的影响。3.初步探讨CUTL1参与恶性黑素瘤发生发展的可能分子机制。[研究方法]1.免疫组化和Western blot法检测转录因子CUTL1在恶性黑素瘤组织和皮内痣组织中的表达,并分析其临床病理学意义。2. RT PCR和Western blot方法检测恶性黑素瘤细胞系(A375、Libr和1585)和原代培养的黑素细胞中CUTL1在mRNA水平和蛋白水平的表达。3.脂质体法将CUTL1特异siRNA载体转染入恶性黑素瘤Libr细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞克隆；包装CUTL1正义逆转录病毒载体,感染原代培养黑素细胞,获得CUTL1表达上调的细胞系。4. MTT实验、克隆形成实验、周期和凋亡检测等观察转录因子CUTL1对转染和感染细胞体外生物学行为的影响。5.裸鼠体内成瘤实验检测干预转录因子CUTL1表达后,对恶性黑素瘤细胞的体内成瘤能力的影响。6. Western blot方法检测上述转染和感染细胞中细胞周期相关分子p27和p21的蛋白表达。[结果]1. CUTL1在恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达。转录因子CUTL1在皮内痣组织中的表达阳性率为16.7%(4/24),而在恶性黑素瘤组织中的表达阳性率为82.4%,其明显高于皮内痣组织(P<0.05)。在恶性黑素瘤组织中,CUTL1的表达与TNM分期相关,TNM分期中,低级别组CUTL1的表达明显高于高级别组(P<0.05),并且CUTL1的高表达与是否发生转移密切相关(P<0.05)。恶性黑素瘤细胞系(A375、Libr和1585)中均有CUTL1的表达,且明显高于其在黑素细胞中的表达。2. CUTL1对恶性黑素瘤细胞体内外生物学行为的影响。感染CUTL1正义载体的黑素细胞较对照细胞,生长速度显著加快,G1期进入S期的细胞比例增加,细胞克隆形成能力显著增强；而转染CUTL1特异siRNA的恶性黑素瘤细胞Libr较对照细胞,生长明显受到抑制,G1期进入S期的细胞比例明显降低,细胞克隆形成能力减弱,裸鼠体内成瘤能力也明显减弱。3. CUTL1对参与细胞周期调节的相关分子的影响。感染CUTL1正义载体的黑素细胞中,参与细胞周期调节的相关分子p27和p21表达下调,而稳定转染siRNA的恶性黑素瘤Libr细胞中,p27和p21表达明显升高。[结论]1.转录因子CUTL1在恶性黑素瘤组织中的表达明显高于皮内痣组织,且CUTL1在恶性黑素瘤中的表达与其恶性进展密切相关。2.转录因子CUTL1可以增强恶性黑素瘤细胞在体内和体外生长增殖的能力。3.转录因子CUTL1至少部分通过调节细胞周期相关分子,促进细胞周期G1/S进展,从而影响恶性黑素瘤细胞的生长增殖能力。
