盐胁迫是造成农作物产量下降的重要原因之一,它可以造成植物体内离子失衡和渗透胁迫,并引发植物的氧化伤害,使植物生长减缓甚至死亡。盐胁迫主要是由Na+离子引起的,维持胞质内较低的Na+离子水平是植物正常生长的重要条件,植物可以通过Na+的外排、Na+的区隔化以及Na+的分泌三种方式来减轻过多的Na+对植物的毒害作用。植物体内Na+的外排和区隔化主要是通过Na+/H+逆向转运蛋白来调节的,其在细胞质膜和液泡膜上均有分布,它参与调节细胞内的Na+浓度、pH及细胞体积变化等生命活动。液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白通过将胞质中多余的Na+区格化到液泡中,这样既可以降低过多Na+对细胞质的损害,又可将Na+作为渗透调节剂来降低细胞的渗透势。大量研究证明,过量表达Na+/H+逆向转运蛋白能够明显提高植物的耐盐性。本实验室在以前的研究中,通过同源序列设计简并引物,利用RT-PCR及RACE技术,在国际上首次从菊花中克隆出Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因DmNHXl,利用酵母互补实验验证该基因有一定的耐盐功能。在本研究中,我们通过转DmNHXl基因在烟草中的瞬时表达和在拟南芥中的稳定表达来进一步研究该基因的功能。本研究构建了植物瞬时表达载体pGRAB-DmNHX1,通过冻融法转入农杆菌AGL1/pSoup,利用农杆菌介导法转入烟草N. benthamiana叶片中,经过UV鉴定得到转化叶片。将转基因叶片在不同NaCl浓度条件下处理5天,随着盐浓度的增加,叶片沿着外边缘向中心逐渐变白,特别是在500mM NaCl处理下,野生型叶片几乎全部变白,而转基因叶片中央还保持绿色;同时,叶绿素测量结果表明,转基因叶片中的叶绿素含量大于对照组,说明转DmNHX1基因可以提高烟草叶片细胞的耐盐性。此外,我们构建植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-DmNHX1,通过冻融法转入农杆菌GV3101,经过由农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥,筛选得到转DmNHX1的纯合子,通过PCR鉴定转基因拟南芥。荧光定量PCR研究发现,50mM NaCl处理下,转DmNHX1的拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因的表达量是野生型植株的1.5倍和1.26倍,100mM NaCl处理下,转DmNHX1的拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因的表达量是野生型植株的2.6倍和2.4倍,说明DmNHX1在转录水平上受盐诱导。在75mM NaCl培养基萌发12天后,转DmNHX1拟南芥幼苗的根长约为2.98cm,而野生型拟南芥幼苗的根长仅为1.85cm,且相比于野生型,转基因幼苗的侧根也更发达。100mM NaCl处理20天后,转DmNHX1拟南芥生长状况明显优于野生型拟南芥,其干重、鲜重、地上部分Na+和脯氨酸含量都高于后者。200mMNaCl处理20天后,野生型拟南芥已经死亡,而转基因拟南芥植株虽然也受到严重影响,但是还可以生长。上述结果证明,转Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因DmNHX1可以提高植物的耐盐性。