JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备

研究背景:绵羊肺腺癌（ovine pulmonary adenocarcinoma, OPA）是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病病毒（jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV）引起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病,世界动物卫生组织将其列为B类传染病。目前国内对该病的诊断主要依靠常规病理学方法检测,严重障碍了我国对OPA的防控。主要目的:建立快速特异的实验室及适用于基层的诊断方法,为临床及基层检测诊断提供技术支持,为进一步分析表面蛋白（ surface protein,SU）蛋白的功能、疫苗设计及对JSRV的生物学特性研究提供素材。研究方法:以获得的三株抗JSRV-SU蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗,应用噬菌体展示结合肽探针扫描技术,鉴定三株单抗所识别的线性表位;并应用非竞争性ELISA法测定三株单抗的功能性亲和常数;以阳性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本,以纯化的多抗和单克隆抗体为基本检测试剂,建立双抗体夹心ELISA检测方法;针对外源性JSRV U3区设计特异性引物,建立JSRV的环介导等温扩增（Loop-mediatedisothennalamplification ,LAMP）检测方法,并以700ng健康羊基因组DNA为背景进行敏感性和特异性试验;通过基因克隆技术对JSRVenv及绵羊ras基因进行序列测定;运用基因重组方法构建JSRVenv重组真核表达质粒,并通过脂质体转染建立稳定表达细胞系。研究结果:1.三株单抗3B3、3D6、1D6的亲和常数分别为5.06×109 L/mol﹑5.82×109 L/mol﹑ 2.91×109 L/mol ;且其所对应的抗原表位分别为W156APEGTPD163,F71SYQSQHPHCI81,D98EKTGKR104;2.首次基于JSRV-SU蛋白的单抗建立了夹心ELISA法,并建立了阴性与阳性的判定标准（当P/N≥2.21时判为阳性;当P/N<1.85时判为阴性;当2.21>P/N≥1.85时判为可疑）;3.在国内首次基于内外源性病毒长末端重复序列（ long terminal repeat ,LTR）的差异建立了LAMP诊断方法,所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用60min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对内源性JSRV的扩增结果为阴性,该方法对JSRV前病毒DNA的最小检测限为10拷贝,灵敏性高于一步PCR方法。LAMP和特异性PCR及套式PCR方法检测临床样品的符合率分别为92 %和100%;4.通过基因克隆技术对JSRVenv及绵羊ras基因进行序列测定,结果发现,本研究克隆的pMD-exJSRVenv1属于Ⅱ型exJSRV;而pMD-exJSRVenv2属于Ⅰ型exJSRV;在exJSRV氨基酸序列中存在“YXXM”基序;绵羊ras基因与已知其他物种的该段基因作比对差异率较小,基本保守,且与牛的ras基因同源性最高;5.成功构建了含有env及tm基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-env及pcDNA3.1-TM-HA,并建立了稳定表达JSRV囊膜蛋白（Env）及其TM亚基的HepG2细胞系。结论:本研究建立了特异性检测JSRV的夹心ELISA法和LAMP法,对于我国养羊业的健康发展,具有重要的实用价值,对研究OPA防制措施等均有重要意义。另外,JSRV env基因的克隆和表达及对绵羊ras基因的序列分析,对于丰富JSRV的分子发病机理以及为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系搭建了重要的实验平台。