石油烃降解菌的筛选及石油污染土壤的生物修复机理研究

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石油作为一种重要的能源物质,是人类生产、生活中不可或缺的生产资料。它是由烃类化合物组成的一种复杂化合物,石油中芳香类物质,尤其是以二环和三环为代表的多环芳烃类物质对人和动物的毒性较大,具有致癌作用。随着人们对石油产品的大量利用,石油污染也随之而来,并且有加重的趋势。因此,如何高效的降解环境中的石油烃以减小石油造成的污染成为人们关注并且研究的重点。本论文分别从陕北子长、陕北清涧、甘肃庆阳三个不同地区的油污土壤中,利用Bushi-hass培养基共富集筛选出16株石油烃降解菌,通过实验研究了筛选出的降解菌对石油烃的降解效果与其理化性质、降解基因之间的关系;于陕北子长供试油污土壤中投加筛选出的降解菌对其进行微生物修复,针对该地区油污土壤状况研究筛选出的降解菌对该区域土壤的修复效果,并进一步从不同处理的修复效果、理化性质、降解基因、土壤降解菌种类数量、修复土壤中微生物群落多样性变化以及降解过程中石油烃组分变化等方面,对陕北子长县油污土壤的微生物降解修复效果进行机理研究。经过实验分析总结得到以下结论:实验筛选出的16株菌分属于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和不能确定种名的假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)和无色杆菌属(Achromobacter)的细菌。从三种不同地区油污土壤中共筛选出16株石油烃降解菌,其中有7株菌株对水相中石油烃20d的降解率为31.5%~54.7%。对菌株的降解基因检测结果表明,当降解菌中同时含有双加氧酶和单加氧酶控制基因时,菌株对石油烃显示出较强的降解能力。在本次石油污染土壤微生物修复过程中,不同的生物处理其修复效果不同,总体修复效果由好到差的顺序为:生物刺激(加入N、P营养物质)>生物强化(投加降解菌)>自然修复。修复石油污染土壤过程中,石油烃降解率与土壤过氧化氢酶和石油烃降解基因的含量之间存在正相关关系。投加外源菌种与加入N、P营养物质均可以提高土壤中过氧化氢酶的含量,而且降解基因含量越多降解效果越好。修复土壤中石油烃和烷烃降解菌显著多于多环芳烃降解菌数量。土壤微生物群落结构的DGGE图谱解析可知,投加外源降解菌SZ-1可以显著提高土壤细菌群落的多样性,说明该外加菌与土壤中的土著菌存在着协同修复作用。根据自然修复、生物强化和生物刺激三种处理的土壤香农指数和辛普森指数测定结果可知土壤中细菌群落多样性与土壤中石油烃的降解率之间有一定的相关关系,细菌群落多样性结构越复杂,对石油烃的降解效果相对越好。在石油污染土壤修复后期,石油烃降解出现停滞期,继续投加N、P营养物质和外源菌种以及细菌菌群对石油烃的继续降解没有明显促进效果,但加入葡萄糖基质进行共代谢处理可以促进难降解石油烃的进一步降解。利用GC-FID测定了一期修复的土壤与原土壤中石油烃组分变化,根据测定结果可知,一期修复中5#(加入氮磷营养物质)处理中对饱和烃降解效果均达到最好。其中5#处理中C14~C30的饱降解率均大于70%。利用GC-FID测定了三期修复土壤石油烃组分变化,根据测定结果可知,4#-1(原SZ-1菌种修复土壤中投加葡萄糖基质,并保持土壤含水率为40%)和5#-2处理(原氮磷修复土壤投加混合菌种二期修复后再投加氮磷营养和葡萄糖基质,并保持40%土壤含水率)对饱和烃和芳烃降解效果相对较好。其中,5#-2处理中C14~C30的饱和烃全部降解。在而4#-1处理中C14~C19的饱和烃降解率大多都>50%。
摘要第3-5页
ABSTRACT第5-6页
1 绪论第10-17页
    1.1 简介第10-11页
        1.1.1 石油的重要性和分布特征第10页
        1.1.2 土壤第10-11页
    1.2 石油污染及危害第11-12页
        1.2.1 土壤石油污染第11-12页
        1.2.2 水体石油污染及危害第12页
        1.2.3 大气石油污染及危害第12页
    1.3 石油污染土壤的主要修复技术及特点第12-14页
        1.3.1 物理修复技术第12-13页
        1.3.2 化学修复技术第13页
        1.3.3 植物修复技术第13页
        1.3.4 微生物修复技术第13-14页
    1.4 土壤微生物检测技术第14-15页
        1.4.1 聚合酶链式反应(PCR)第14-15页
        1.4.2 变性梯度凝胶电泳(DGGE)第15页
        1.4.3 最大或然数计数法(MPN)第15页
    1.5 论文研究内容、目的和意义第15-17页
2 石油降解菌的筛选与鉴定第17-22页
    2.1 实验材料和方法第17-20页
        2.1.1 石油降解菌菌源土壤性质测定方法第17-18页
        2.1.2 实验培养基及试剂第18页
        2.1.3 实验仪器第18页
        2.1.4 石油降解菌筛选方法第18-19页
        2.1.5 菌种的 PCR 扩增及 16S rRNA 基因序列分析方法第19-20页
    2.2 实验结果与分析第20-22页
3 石油烃降解菌的降解效果、理化性质及降解基因检测第22-33页
    3.1 实验材料第22-23页
        3.1.1 实验培养基及试剂第22页
        3.1.2 实验仪器第22-23页
    3.2 实验方法第23-27页
        3.2.1 降解菌对石油烃的降解效果测定方法第23页
        3.2.2 降解菌的理化性质测定方法第23-25页
            (一) 菌株乳化性质测定方法第23页
            (二) 菌株排油圈直径测定方法第23页
            (三) 菌株淀粉酶实验方法第23-24页
            (四) 菌株甲基红实验(M-R 实验)方法第24页
            (五) 菌株过氧化氢酶实验方法第24-25页
        3.2.3 菌株降石油烃解基因测定方法第25-27页
    3.3 实验结果与分析第27-33页
        3.3.1 菌株的石油烃降解效果与其理化特性测定结果第27-30页
        3.3.2 菌株所含石油烃降解基因测定结果第30-33页
4 石油污染土壤的一期微生物修复实验第33-68页
    4.1 实验材料第33-35页
        4.1.1 实验试剂第33-35页
        4.1.2 实验仪器第35页
    4.2 一期微生物修复实验方案设计及实验方法第35-44页
        4.2.1 微生物修复实验方案第35-36页
        4.2.2 修复土壤中石油烃含量的测定方法第36页
        4.2.3 修复第 8 周时土壤中不同组分的石油烃测定方法第36-38页
        4.2.4 土壤过氧化氢酶的测定方法第38页
        4.2.5 土壤中石油烃降解基因检测方法第38-40页
        4.2.6 土壤中石油烃、烷烃、多环芳烃降解菌个数检测(MPN 法)第40-41页
        4.2.7 土壤微生物群落分析(PCR-DGGE 及克隆测序分析)第41-44页
    4.3 实验结果与分析第44-68页
        4.3.1 不同修复处理对土壤中石油烃的去除效果第44-46页
        4.3.2 修复第 8 周时土壤中不同组分的石油烃测定结果第46-48页
        4.3.3 修复土壤中过氧化氢酶含量测定结果第48-49页
        4.3.4 修复土壤中的石油烃降解基因检测结果第49-51页
        4.3.5 修复土壤中降解菌数量测定结果第51-59页
        4.3.6 不同处理土壤中的微生物群落分析(DGGE 及克隆测序分析)第59-68页
5 微生物修复后期探索实验第68-77页
    5.1 实验材料第68页
        5.1.1 实验培养基及试剂第68页
        5.1.2 实验仪器第68页
    5.2 微生物修复实验方案及方法第68-71页
        5.2.1 二期微生物修复实验方案第68-69页
        5.2.2 三期微生物修复实验方案第69-70页
        5.2.3 微生物修复降解效果测定方法第70-71页
        5.2.4 三期微生物修复土壤石油烃组分测定方法第71页
    5.3 实验结果与分析第71-77页
        5.3.1 二、三期微生物修复效果评价第71-73页
        5.3.2 修复土壤中石油烃组分测定第73-77页
6 结论与建议第77-79页
    6.1 石油降解菌的筛选及其理化性质和降解基因检测第77页
    6.2 石油污染土壤不同生物处理的生物修复过程第77-78页
    6.3 实验建议第78-79页
致谢第79-80页
参考文献第80-86页
附录第86页
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