目的:肿瘤的发生与发展都与肿瘤血管生成密切相关。肿瘤血管生成是一个复杂的过程,由多种促血管生成和抗血管生成因素共同调节。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是最重要的促血管生成因子。活性氧(reactive oxygen species,ROS)对VEGF的促血管生成作用有明显调节作用。因此,从抗氧化剂中寻找具有抗血管生成活性的物质为肿瘤治疗提供了一条新思路。稳定氮氧自由基有独特的抗氧化活性,本实验研究2种稳定氮氧自由基及其还原物的抗肿瘤和血管生成活性及机制,通过分析构效关系,探讨稳定氮氧自由基及其还原物对血管生成的影响,分析ROS在肿瘤血管生成中的作用。方法:采用SRB(磺酰罗丹明B,SulforhodamineB)法检测对肺癌细胞A549,结肠癌细胞SW620及人微血管内皮细胞(HMEC-1)增殖的影响;采用Transwell小室体外检测对HMEC-1迁移的影响;管样结构形成实验分析对HMEC-1的管状结构形成的作用;应用明胶酶谱法检测对HMEC-1分泌的基质金属蛋白酶-2(Matrix metallopeptidase 2,MMP-2)的作用。以 DCFH-DA(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate)作为荧光探针,采用荧光倒置显微镜和流式细胞术检测对VEGF刺激HMEC-1细胞所产生的ROS的影响。Western blot法检测VEGF刺激的HMEC-1细胞VEGFR2磷酸化及其下游因子ERK1/2的活化;流式细胞术分析对HMEC-1细胞周期和凋亡的影响。结果:SRB实验显示4-OH-Tempo对肿瘤细胞A549和SW620及HMEC-1的IC50 略低于 4-OH-TempOH;4-O-Tempo 对肿瘤细胞 A549 和 SW620 及 HMEC-1增殖的抑制效果显著,4-O-TempOH抑制效果不明显。4-OH-Tempo和4-OH-TempOH对HMEC-1的迁移几乎具有相同的抑制效果,呈现一致的剂量依赖性;4-O-Tempo 和 4-O-TempOH 效果同上;4-OH-TempOH 和 4-O-TempOH 对HMEC-1分泌MMP-2具有抑制作用,其他4种药物没有抑制效果。4-OH-Tempo和4-OH-TempOH对HMEC-1管样结构的形成具有相似的抑制效果;4-O-Tempo和 4-O-TempOH 效果同上;4-OH-Tempo 和 4-OH-TempOH,4-O-Tempo 和4-O-TempOH能抑制VEGF诱发的HMEC-1的VEGFR2的磷酸化;只有4-O-TempOH 可以抑制 ERK1/2 的磷酸化,而 4-OH-Tempo、4-OH-TempOH、4-O-Tempo、4-OH-TempH 和 4-O-TempH 对于 ERK1/2 的磷酸化均无影响。4-OH-Tempo 和 4-OH-TempOH,4-O-Tempo 和 4-O-TempOH 均能剂量依赖性的促进HMEC-1发生凋亡;4-OH-Tempo和4-O-Tempo均可以成双向性的改变HMEC-1的细胞周期,短暂的减少处于G1期的细胞而后处于G1期的细胞不变或者增加;同时处于S期的细胞先增加然后减少。4-OH-TempOH和4-O-TempOH均剂量依赖性的降低G1期细胞比例,并剂量依赖性的增加S期细胞比例。而4-OH-TempH和4-O-TempH对上述指标均无明显影响。结论:稳定氮氧自由基及其羟基还原物均能明显抑制肿瘤细胞A549和SW620及内皮细胞HMEC-1的生长,对HMEC-1的迁移、管样结构形成以及VEGF刺激的VEGFR2磷酸化均有相似的抑制作用,而氢还原物无此作用,上述作用量效关系与清除VEGF刺激HMEC-1细胞所产生的ROS相似,说明ROS参与细胞生长和血管生成的全过程。
