陈化烤烟烟叶表面优势菌株的定量检测与诱变增效研究

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本文以复烤后新烟和烟叶表面筛选出的优势菌株为试材,采用荧光定量PCR技术对不同陈化阶段烟叶表面优势菌株的DNA拷贝数进行了定量检测,采用微生物学、酶学和分子生物学等技术和手段对不同陈化时期烟叶的酶活性进行测定;通过向复烤后烟叶表面喷施优势菌株来研究微生物制剂对烟叶品质的影响;同时利用复合诱变剂对烟叶表面优势菌株进行诱变育种研究。研究结果如下:1.烟叶表面优势菌株的DNA拷贝数的定量检测及不同陈化时期烤烟烟叶中4种酶活性的动态变化。结果表明,随着陈化时间的延长,巨大芽孢杆菌的DNA拷贝数呈先升高后降低的趋势,在陈化6个月时的每克烟叶表面所含有的巨大芽孢杆菌的DNA拷贝数最多;4种酶的活性也呈先升高后降低的趋势,在陈化6个月时酶活性达到最大值;化学成分含量呈下降趋势。巨大芽孢杆菌的DNA拷贝数的变化影响烟叶中酶活性及化学成分含量的变化,表明巨大芽孢杆菌是烟叶自然陈化的内在动力。2.微生物制剂对复烤烟叶品质的影响研究。采用荧光定量PCR技术对添加微生物制剂的烟叶和对照的烟叶表面优势菌株DNA拷贝数进行定量检测,同时,测定了不同陈化时期复烤烟叶中4种酶活性和化学成分含量及中性香气物质含量。通过向复烤后烤烟烟叶表面接种巨大芽孢杆菌的处理效果表明,烟叶表面优势菌株的DNA拷贝数明显高于对照烟叶,4种酶的活性显著高于对照,化学成分含量及其比值更加协调,同时发酵烟叶中大多数香气物质成分含量与其对照相比表现为明显的增加趋势,证明利用优势菌株及其生物制剂是增进陈化烟叶香气质量,缩短烟叶发酵周期的重要途径。3.烟叶表面优势菌株的诱变育种研究。以从烟叶表面筛选得到的巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)BCK为出发菌株,经理化因子诱变处理,采用透明圈法进行初筛,即在淀粉培养基和蛋白培养基平板上挑取Hc值(透明圈直径与菌株直径之比)都比较大的菌株,然后对这些菌株进行摇瓶复筛,测发酵液α-淀粉酶和蛋白酶的活性,得到酶活性较高的菌株B8。其产生的α-淀粉酶活性是BCK的1.905倍,蛋白酶活性是BCK的2.227倍。该菌株能稳定遗传,经五代传代培养后,其产生的α-淀粉酶活性是出发菌株的1.908倍;蛋白酶活性是出发菌株的1.926倍。
致谢第4-7页
摘要第7-8页
1 文献综述第8-15页
    1.1 关于微生物对烟叶发酵品质的改进与发酵机理研究第8-10页
    1.2 生物制剂在烟叶发酵中的应用研究第10-15页
    1.3 前景与展望第15页
2 引言第15-17页
3 材料与方法第17-21页
    3.1 不同陈化时期烟叶中酶活性及化学成分含量测定试验第17页
        3.1.1 试验材料第17页
        3.1.2 测定项目和方法第17页
    3.2 不同陈化时期烟叶表面优势菌株的定量检测第17-19页
        3.2.1 不同陈化时期烟叶表面细菌微生物总DNA 的提取第17-18页
        3.2.2 细菌总DNA 粗提物的纯化第18页
        3.2.3 引物设计第18页
        3.2.4 标准品制备第18页
        3.2.5 标准品的克隆测序第18页
        3.2.6 标准曲线绘制及菌体拷贝数的定量第18-19页
    3.3 烟叶表面优势菌株的诱变育种试验第19-20页
        3.3.1 材料第19页
        3.3.2 方法第19-20页
    3.4 诱变菌株增香效应实验第20-21页
        3.4.1 试验材料第20页
        3.4.2 试验设计第20-21页
        3.4.3 挥发性香气成分的测定第21页
    3.5 不同处理烟叶内在质量感官评吸鉴定第21页
4 结果与分析第21-40页
    4.1 不同陈化时期烤烟烟叶中几种酶活性的动态变化第21-23页
        4.1.1 不同陈化时期烤烟烟叶中淀粉酶活性的动态变化第21页
        4.1.2 不同陈化时期烤烟烟叶中蛋白酶活性的动态变化第21-22页
        4.1.3 不同陈化时期烤烟烟叶中多酚氧化酶活性的动态变化第22页
        4.1.4 不同陈化时期烤烟烟叶中过氧化物酶活性的动态变化第22-23页
    4.2 不同陈化时期烤烟烟叶中主要化学成分含量分析第23-27页
        4.2.1 不同陈化时期烤烟烟叶中淀粉含量分析第23页
        4.2.2 不同陈化时期烤烟烟叶中中性蛋白质含量分析第23-24页
        4.2.3 不同陈化时期烤烟烟叶中多酚含量分析第24页
        4.2.4 不同陈化时期烤烟烟叶中其它化学成分含量分析第24-27页
    4.3 不同陈化时期烟叶中性挥发性香气物质成分的含量分析第27-32页
        4.3.1 不同陈化时期对照烟叶中各类香气物质含量第30-31页
        4.3.2 不同陈化时期处理烟叶中各类香气物质含量第31-32页
        4.3.3 不同陈化时期处理与对照烟叶中致香物质分析比较第32页
    4.4 不同陈化时期烟叶表面优势菌株DNA 拷贝数的定量检测第32-35页
        4.4.1 烟叶表面微生物总DNA 的提取第32页
        4.4.2 标准品制备及标准曲线第32-33页
        4.4.3 熔解曲线分析第33-34页
        4.4.4 不同陈化时期烟叶表面巨大芽孢杆菌定量结果第34-35页
    4.5 优势菌株诱变育种研究第35-39页
        4.5.1 诱变剂剂量选择第35-36页
        4.5.2 初筛第36-37页
        4.5.3 复筛第37-38页
        4.5.4 遗传稳定性实验第38-39页
        4.5.5 诱变菌株的增香效应第39页
    4.6 不同处理烟叶内在质量感官评吸鉴定结果影响第39-40页
5 结论与讨论第40-44页
    5.1 不同陈化时期烟叶中酶活性及化学成分含量的动态变化第40-41页
    5.2 不同陈化时期烤烟烟叶表面优势菌株的荧光定量第41-42页
    5.3 微生物制剂的增香效应第42-43页
    5.4 烟叶表面优势菌株的诱变育种第43-44页
参考文献第44-49页
ABSTRACT第49-50页
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