研究目的1.探讨BMSCs在胰腺损伤修复中的作用2.探讨BMSCs在慢性胰腺炎纤维化中的作用3.探讨MicroRNA是否可以作为CP-PDAC过程中标志物研究方法1.建立C57/BL6小鼠胰腺损伤模型(65%～70%胰腺部分切除),通过尾静脉注射表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的小鼠BMSCs (GFP+ BMSCs的表面标志用流式细胞术检测,成脂和成骨分化能力用相应的成脂和成骨培养基诱导检测),应用GFP免疫组织化学技术分析BMSCs在损伤胰腺中的迁移与分布；运用胰腺导管上皮标志CK-19,胰岛p细胞标志Insulin,胰腺星状细胞标志Desmin和α-SMA,血管内皮细胞表面标志CD31和神经细胞标志Nestin与GFP免疫荧光双染激光共聚焦成像技术分析胰腺组织中BMSCs的表型,并统计GFP+/CK19+, GFP+/Insulin+, GFP+/Desmin+, GFP+/α-SMA+, GFP+/CD31+, GFP+/Nestin+亚群所占比例；用电子秤称量手术四周后的小鼠体重和胰腺重量,计算胰腺／体重比；将四周后的小鼠胰腺消化为单细胞悬液,用流式细胞术分选出GFP+的细胞。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分选出的GFP+的细胞,野生型(Wild type) BMSCs和GFP+ BMSCs中4种MicroRNA (miR-9, miR-204, miR-375和miR-34a)的表达。接受GFP+ BMSCs注射的正常小鼠和不接受GFP+ BMSCs注射的胰腺损伤小鼠作为对照。2.建立C57/BL6小鼠慢性胰腺炎模型(蛙皮素诱导8周),通过尾静脉注射GFP+小鼠BMSCs(表面标志和成脂成骨能力检测同前),应用GFP免疫组织化学技术分析BMSCs在纤维化胰腺中的迁移与分布；运用胰腺星状细胞标志Desmin和α-SMA, MMP-2和MMP-9与GFP免疫荧光双染激光共聚焦成像技术分析胰腺组织中BMSCs的表型,并统计GFP+/CK19+, GFP+/Insulin+, GFP+/Desmin+, GFP+/α-SMA+, GFP+/CD31+亚群所占比例；用天狼星红(Sirius red)染色和Image Pro Plus软件检测胰腺组织的纤维化程度；用Western blotting技术检测胰腺组织中MMP-9和MMP-2的表达水平。不接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎胰腺小鼠作为对照。3.建立大鼠慢性胰腺炎-胰腺癌(CP-PDAC)模型：将大鼠胰胆管部分结扎(75%),8周内形成慢性胰腺炎,然后在大鼠胰腺内包埋二甲基苯并葸(7,12-dimethylbenzanthracene, DMBA)粉末,三个月内形成胰腺癌。只包埋DMBA的大鼠作为对照组。在不同时间点取大鼠模型的胰腺标本,用qRT-PCR检测不同病变程度胰腺中相关MicroRNA (miR-34a,miR-204, miR-107和miR-21)的表达,比较MicroRNA在正常胰腺,不同程度纤维化胰腺,PanINs病变和PDAC中的表达差异。实验结果1.免疫组化的结果显示GFP广泛表达于损伤胰腺的实质和间质中,其中导管结构中有18.5±3.3%,血管结构中有23.4±5.6%,腺泡结构中有3.4±1.5%,胰岛结构中没有,其它间质中有54.7±8.9%。免疫荧光双染共聚焦技术显示GFP+BMSCs分化为胰腺导管上皮细胞(占1.7±0.3%),胰腺星状细胞(占5.2±1.6%),血管内皮细胞(占3.2±0.6%),没有发现其分化为胰岛细胞和神经细胞。损伤胰腺中的GFP+ BMSCs和其分化的细胞远多于正常胰腺。对于部分切除胰腺的小鼠,接受GFP+ BMSCs注射的小鼠的胰腺重量／体重比((0.225±0.042)%)高于未接受GFP+ BMSCs注射的小鼠((0.183±0.021)%)(p<0.05)。另外,实时定量PCR的结果显示miR-9和miR-204在定植于胰腺的BMSCs中的表达高于野生型BMSCs和GFP+ BMSCs(分别为5.2-fold和2.6-fold, p<0.05)。miR-375在定植于胰腺的BMSCs中表达降低(0.71-fold, p<0.05),而niR-34a的表达没有明显改变。2.HE染色显示蛙皮素处理8周后出现典型慢性胰腺炎特征,免疫组化的结果显示GFP广泛表达于纤维化胰腺的实质和间质中,免疫荧光双染共聚焦技术显示GFP+BMSCs分化为胰腺星状细胞(GFP+/Desmin+和GFP+/α-SMA+)(占7.5±2.3%),部分GFP+BMSCs表达MMP-2和MMP-9。Image Pro Plus软件检测天狼星红染色的胰腺切片,发现接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎小鼠的纤维化面积占4.56%±0.63%,小于未接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎小鼠(7.37%±0.92%, P< 0.05)。Western blotting结果显示接受BMSCs处理的胰腺组织中MMP-2和MMP-9的表达高于未接受BMSCs处理的胰腺组织。3.实时荧光定量PCR结果显示：相对于慢性胰腺炎大鼠胰腺,miR-34a在PanIN-1, PanIN-2, PanIN-3和PDAC病变组织中表达显著升高(p<0.05),miR-204在PanIN-2, PanIN-3和PDAC病变组织中表达显著降低(p<0.05),miR-21在PanIN-3和PDAC病变组织中表达显著升高(p<0.05),而miR-107只在PDAC病变组织中表达升高(p<0.05)。实验结论1.外周血中的BMSCs能迁移到损伤的胰腺中,并能通过分化为胰腺导管细胞,血管内皮细胞和胰腺星状细胞参与胰腺的损伤修复,促进胰腺再生。miR-9, miR-204和miR-375可能参与BMSCs在胰腺中的分化过程。2.外周血中的BMSCs能迁移到纤维化的胰腺中,能通过表达MMP-2和MMP-9降低胰腺的纤维化程度,同时也能分化为胰腺星状细胞参与纤维化形成过程。3. miR-34a和miR-204能早期鉴别大鼠的慢性胰腺炎与PanINs病变,可能参与胰腺癌的早期癌变过程。
