BSO介导氧化应激联合顺铂促人肺腺癌A549干细胞球凋亡的研究

背景：当前，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)死亡率呈现逐年递增趋势，居恶性肿瘤死因之首。但由于肺癌肿瘤组织中存有高耐药导致顺铂（diamminedichloroplatinum，DDP）化疗失败，成为临床迫切解决的课题。“肿瘤干细胞假说”理论认为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是肿瘤组织中的极少数具有干细胞特性的细胞群体，尚未充分分化的原始细胞，具有自我更新和多向分化潜能。单个CSCs即具有致瘤性，可能是肿瘤再发的始动细胞。本课题前期研究已成功分离出肺腺癌CSCs，相比非CSCs具有低线粒体DNA拷贝数、胞内低活性氧（reactive oxygen species，ROS）浓度、低葡萄糖及低耗氧等独特的能量代谢特征，同时认为维持CSCs胞内低ROS浓度与其自我更新、多向分化及高致瘤性密切相关。鉴于ROS在肿瘤放疗促凋亡的重要作用，我们认为CSCs胞内ROS浓度的高低亦可影响肿瘤化疗药物的疗效，促CSCs胞内ROS蓄积的联合化疗或可成为肿瘤综合治疗新策略。因此，本研究拟人肺腺癌A549细胞经无血清培养基（serum-free medium，SFM）培养A549干细胞球，探讨A549细胞与A549干细胞球间的谷胱甘肽-硫-转移酶π（glutathione-S-transferase-π，GST-π）表达及胞内ROS浓度差异情况；同时针对该两种细胞分别以空白对照组、顺铂组、GST-π抑制剂丁硫氨酸-亚砜亚胺（DL-buthionine-S,R-sulfoximine，BSO）联合DDP组及N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）联合DDP组干预，并检测各组与之对应的ROS浓度及凋亡率。目的：1、比较A549单细胞克隆不同形态的胞内ROS浓度。2、比较A549细胞和A549干细胞球不同药物组合干预后GST-π的表达、胞内ROS浓度及凋亡率的差异，同时探讨三者的相关性。方法：1、采用荧光显微镜检测A549单细胞克隆不同形态的胞内ROS浓度。2、通过Western Blot检测A549细胞和A549干细胞球不同药物组合干预24h后GST-π蛋白表达水平。3、利用流式细胞术检测A549细胞和A549干细胞球不同药物组合干预24h后胞内ROS浓度及凋亡率。结果：1、A549紧密型克隆细胞胞内ROS浓度明显低于松散型（24.13±1.79vs77.89±6.71P<0.01）。2、A549干细胞球较A549细胞高表达GST-π蛋白（1.45±0.07vs1.25±0.06P<0.05），同时维持胞内低ROS浓度（272.67±16.04vs326.33±12.34P<0.01）；顺铂干预后前者胞内ROS浓度上升幅度较后者小（585±12.12vs768.67±9.02P<0.01），凋亡增加幅度亦较后者小（13.74±1.51vs23.23±1.08P<0.01）。3、A549细胞及A549干细胞球经过NAC联合顺铂与单用顺铂干预后相比，两种细胞均表现胞内ROS浓度显著下降（A549细胞547.67±9.07vs768.67±9.02P<0.01，A549干细胞球452.33±16.16vs585.00±12.12P<0.01），凋亡亦较单用顺铂减少（A549细胞12.47±1.50vs23.23±1.08P<0.01，A549干细胞球8.43±1.10vs13.74±1.51P<0.01）。4、A549干细胞球及A549细胞经过BSO联合顺铂干预后相比，前者更低表达GST-π蛋白（0.51±0.05vs0.83±0.05P<0.05）、胞内ROS浓度明显蓄积（1651.00±28.62vs1486.67±10.02P<0.01）、并伴有凋亡增幅明显（34.20±2.01vs29.05±1.08P<0.01）。结论：1、 A549干细胞球高表达GST-π蛋白并维持胞内低ROS浓度，可能是LCSCs化疗耐药的原因之一。2、抗氧化剂NAC能够有效清除肿瘤胞内ROS，抑制顺铂凋亡效应。3、BSO抑制GST-π表达，并触发ROS大量蓄积，介导氧化应激促进A549干细胞球化疗凋亡，能够起到化疗增敏效应。