全基因组扫描结合基因芯片技术研究KK/Ta小鼠糖尿病肾病遗传易感基因

目的：随着糖尿病发病率的逐年上升及糖尿病病人寿命的延长，糖尿病肾病(DN)已成为糖尿病患者致死和致残的主要原因之一。许多证据提示，遗传因素在糖尿病肾病的发生中起着重要作用。寻找糖尿病肾病相关基因，揭示其生物学功能，探讨其在糖尿病肾病发生、发展过程中的作用，对于加深对糖尿病肾病分子机制的认识，提高糖尿病肾病的诊治水平无疑是很必要的。 对糖尿病肾病的易感基因定位研究有两条途径：一是全基因组扫描法(genome-wide scanning)法，一是候选基因(candidate gene)法。当糖尿病肾病易感基因及其所在染色体位置不清楚时，应采用基因组扫描，先确定相关的染色体区域，再寻找特定基因。人源标本的不足、遗传背景的复杂性和不可控性是长期以来困扰人类疾病研究的难题。以模型动物代替人体实验是解决这一问题的常用方法。动物模型用于糖尿病肾病基因定位时常采用数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)法。对KK／Ta小鼠、KK-Ay小鼠以及OLEFT大鼠等2型糖尿病模型动物的全基因组扫描法分析研究已定位出数个与葡萄糖耐量异常、高脂血症、肥胖等相关的易感基因座位。得出的结论在不同模型、不同研究中不尽相同，有时还互相矛盾，与糖尿病肾病相关的遗传易感基因座位国内外尚无报道。 本研究拟从以下三方面进行糖尿病肾病易感基因的筛选与分析： 1．全基因组扫描定位2型糖尿病KK／Ta小鼠糖尿病肾病遗传易感基因座位。 2．运用基因芯片技术分析KK／Ta糖尿病肾病小鼠肾脏基因表达谱。 3．选择全基因组扫描定位结合基因芯片技术分析提示的可能易感基因，应用竞争性RT-PCR(Competitive RT-PCR)及基因组DNA及cDNA序列分析方法对该基因的表达及多态性进行深入研究。 4．通过人类同源基因的分析，为人类糖尿病肾病易感基因的定位提供线索与依据。 本研究由三部分组成： 论文一 全基因组扫描研究KK／Ta小鼠糖尿病肾病候选基因座位 方法：近交纯品系KK／Ta、BALB／c小鼠购于日本东京CLEA实验动物中心。以雌性BALB/C小鼠与雄性K份Ta小鼠交配建立第一代杂交小鼠(Fl)。回交小鼠以雄性(K称Ta xBALB/c)Fl与雌性K称Ta小鼠回交，实验中使用的回交小鼠全部为雄性，共208只。提取回交小鼠尾部组织，抽提基因组DNA。选用在KK/Ta、BALB/c小鼠间具有多态性的微卫星遗传标记，共计101个，覆盖小鼠19条染色体。PCR扩增微卫星DNA片段，PCR产物经聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)后，根据扩增的微卫星DNA分离片段大小决定回交小鼠基因型，在PAGE胶上为一条片段，则为称K型，二条片段为份B型。同时测定体重、血糖、尿白蛋白及尿肌醉等表现型。采用基因定位专用软件(MAPMAKE份QTL，Map manager)进行数量性状位点(quantitative trait loeus，QTL)分析，以对数优势积分(109 odds seores，助ds)鑫1 .9为建议连锁，助ds鑫3.3为显著连锁。 结果:K称Ta小鼠空腹血糖水平、经腹腔葡萄糖耐量试验空腹与注射后2小时血糖之和显著高于BALB/c小鼠(P<0.001)，而Fl小鼠与BALB/c小鼠之间无显著性差异。此结果提示决定血糖水平的K灯Ta基因是以一种不完全显性或隐形方式遗传的。20和28周龄的K份Ta小鼠平均尿白蛋白水平显著高于BALB/c和Fl小鼠(P<0.0001)(表1)。Fl小鼠的平均尿白蛋白水平介于K称Ta与BALB/。小鼠之间，与BALB/。小鼠的差异有显著性(P<0.0001)。表明决定尿白蛋白水平的K称Ta等位基因以一种不完全显性的方式遗传。 20周龄与28周龄的尿白蛋白水平与第二条染色体83.0 cM DZMit3n微卫星DNA标记附近区域显著连锁，最大LoD值为3 .5(扩二13 .2，P二0.0003)，我们将这一易感基因座位命名为UA一1(尿白蛋白水平1)。将回交小鼠按UA一1区域微卫星标记DZMit3 11等位基因的不同分为二组，纯合的K称KK组与杂合的K称BALB组。K叮KK组20周龄与28周龄的尿白蛋白水平显著高于K称BALB组回交小鼠(P<0.0001)。 该部分研究表明，与2型糖尿病K份Ta小鼠尿白蛋白水平紧密连锁的易感基因座位位于第二条染色体83 .ocM处DZMit3n微卫星DNA标记附近区域，我们将其命名为UA一1。同源分析表明，UA一1与人第20条染色体着丝粒附近区域同源，接近于2型糖尿病匹马印地安人糖尿病肾病易感基、因座位(GATA65 Eol附近区域)。在UA一1区域的附近存在着几个可能的候选基因，包括生长激素释放激素(CHrH)基因‘hrh、生长抑素受体4基因Slnstr4、血管新生素4基因AgP风、血栓调节蛋白(TM)基因Thbd等。通过对此区域候选基因的深人研究，必将为揭示人类2型糖尿病与糖尿病肾病的遗传学背景提供线索与依据。论文二K份Ta糖尿病肾病小鼠肾脏基因表达谱的研究 方法:20周龄雄性KK/Ta(n二3)、BALB/c(n二2)小鼠摘除眼球放血后，迅速取下双侧肾脏，抽提总RNA，逆转录制成。DNA后，体外转录合成cRNA探针。基因芯片为A场metrix公司生产的月升metrixM而ne GenomeU74AvZ，芯片的杂交、洗脱、染色及检测利用月封metrix公司生产的专用设备“基因芯片检测工作站”(workstation)进行，过程的一切操作均按A