枯草芽孢杆菌WHNB02中性植酸酶基因在巨大芽孢杆菌中表达研究

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本研究从课题组成功克隆的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WHNB02中性植酸酶基因phyC(GenBank No:AF AY220075)出发,从信号肽切割位点序列之后设计上游引物(引入一个SacⅠ酶切位点),在终止密码子处设计下游引物(引入一个BamHⅠ酶切位点),通过PCR去除该酶的信号肽编码序列。PCR扩增得到大小约1.1Kb的单一条带产物,即为目的基因表达片段。该产物经回收纯化后连接到T载体pMD18T上,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,经PCR,酶切,测序鉴定后,获得阳性克隆菌株。提取质粒,进行SacⅠ、BamHⅠ双酶切,与经相同双酶切处理的巨大芽孢杆菌表达载体pHIS1525连接,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选到阳性菌落后提取质粒,并电击转化巨大芽孢杆菌WH320电击感受态细胞,使之在表达载体自身信号肽的引导下进行分泌表达。在含有10μg/mL的Tet抗性平板上筛选后,经菌落PCR鉴定,获得阳性克隆菌株。通过植酸酶酶活测定表明产物具有植酸酶活性。SDS-PAGE分析表明该酶相对分子量约为55KDa。初步优化基因工程菌的培养条件,结果表明:最优条件为接种5%种龄为12h的液体种子,培养4h加入终浓度为0.2%木糖诱导,诱导9h后上清液中酶活可达33U/mL,是出发菌株枯草芽孢杆菌WHNB02的165倍。基因工程菌经液体补料分批发酵9h后,中性植酸酶酶活达到45.3U/mL。中性植酸酶由于研究较少,产酶量较低等原因的尚无商品投入市场。本研究在巨大芽孢杆菌中表达中性植酸酶,并有效的提高了其表达量,具有重要的学术价值和应用前景,为中性植酸酶作为商品投入市场打下了良好的基础。
中文摘要第4-5页
Abstract第5-6页
1.前言第10-23页
    1.1 植酸酶概述第10-12页
    1.2 中性植酸酶基因分子生物学研究进展第12-13页
    1.3 中性植酸酶的基因工程研究第13-17页
    1.4 巨大芽孢杆菌基因工程菌表达外源蛋白的国内外研究进展第17-21页
    1.5 表达中性植酸酶工程菌的高密度发酵研究第21-22页
    1.6 本研究的前期工作基础第22页
    1.7 本研究的目的意义及创新点第22-23页
2.技术路线第23-24页
3 材料第24-28页
    3.1 菌株及载体第24页
    3.2 分子生物学试剂第24-25页
    3.3 主要药品第25页
    3.4 抗生素贮存液第25页
    3.5 常用缓冲液第25-27页
    3.6 培养基第27-28页
    3.7 主要仪器第28页
4.方法第28-37页
    4.1 中性植酸酶phyC基因的获得第28-31页
        4.1.1 引物设计第28页
        4.1.2 PCR扩增中性植酸酶phyC基因第28-29页
        4.1.3 中性植酸酶phyC基因表达片段的克隆及鉴定第29-31页
        4.1.4 中性植酸酶phyC基因表达片段的获得第31页
    4.2 巨大芽孢杆菌表达质粒的构建第31-34页
        4.2.1 pHIS1525表达载体的扩增第32页
        4.2.2 pHIS1525载体质粒DNA的处理第32-33页
        4.2.3 pHIS1525载体质粒与中性植酸酶phyC基因表达片段连接及转化第33页
        4.2.4 阳性克隆的筛选及鉴定第33-34页
    4.3 巨大芽孢杆菌基因工程菌构建和表达研究第34-37页
        4.3.1 表达载体pHIS1525-phyC的电击转化第34页
        4.3.2 重组巨大芽孢杆菌的筛选第34页
        4.3.3 中性植酸酶phyC基因在巨大芽孢杆菌中的诱导表达第34-35页
        4.3.4 植酸酶活性的测定第35页
        4.3.5 表达产物的SDS-PAGE检测第35-36页
        4.3.6 植酸酶基因工程菌培养条件的初步研究第36-37页
    4.4 重组巨大芽孢杆菌基因工程菌的补料分批发酵第37页
        4.4.1 斜面培养第37页
        4.4.2 种子制备第37页
        4.4.3 补料分批发酵条件控制第37页
5.结果第37-51页
    5.1 中性植酸酶phyC基因的获得第37-40页
        5.1.1 引物设计第37-38页
        5.1.2 PCR扩增中性植酸酶phyC基因第38页
        5.1.3 中性植酸酶phyC基因表达片段的克隆及鉴定第38-40页
        5.1.4 中性植酸酶phyC基因表达片段的获得第40页
    5.2 巨大芽孢杆菌表达质粒的构建第40-43页
        5.2.1 pHIS1525表达载体的扩增第40-41页
        5.2.2 pHIS1525载体质粒DNA的处理第41-42页
        5.2.3 pHIS1525载体质粒与中性植酸酶phyC基因表达片段连接及转化第42页
        5.2.4 阳性克隆的筛选及鉴定第42-43页
    5.3 巨大芽孢杆菌基因工程菌构建和表达研究第43-50页
        5.3.1 表达载体pHIS1525-phyC的电击转化第43-44页
        5.3.2 重组巨大芽孢杆菌的筛选第44页
        5.3.3 phyC基因在巨大芽孢杆菌中的诱导表达及酶活的测定第44-45页
        5.3.4 表达产物的SDS-PAGE检测第45-46页
        5.3.5 植酸酶基因工程菌培养条件的初步研究第46-50页
    5.4 重组巨大芽孢杆菌基因工程菌的补料分批发酵第50-51页
6.讨论第51-55页
    6.1 信号肽对外源基因表达的影响第52-53页
    6.2 巨大芽孢杆菌基因工程菌构建的关键技术第53页
    6.3 宿主菌对外源基因表达的影响第53-54页
    6.4 培养条件对外源基因表达的影响第54页
    6.5 补料分批发酵对外源基因表达的影响第54-55页
    6.6 进一步研究的建议第55页
7.结论第55-56页
参考文献第56-61页
致谢第61-62页
攻读硕士学位期间发表的论文第62页
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